‘无籽瓯柑’CsRAD51基因的克隆及在花粉发育过程中的表达分析

发布时间：2019-09-17 19:37

【摘要】：‘无籽瓯柑’的雄性不育主要表现为花粉败育,起始于小孢子母细胞减数分裂时期。本研究克隆了‘无籽瓯柑’减数分裂相关基因Cs RAD51,并采用荧光定量PCR检测其在瓯柑及‘无籽瓯柑’中的表达差异。结果显示,Cs RAD51基因的c DNA全长1210 bp,含有一个1029 bp的ORF区;其编码的蛋白质属于疏水性蛋白,分子量45740.1D,氨基酸数388,原子总数6 555,等电点10.20。同源性比对发现,‘无籽瓯柑’Cs RAD51的氨基酸序列与甜橙、麻疯树、油棕、黄瓜、黑杨等的RAD51蛋白高度同源,分别达99%,98%,98%,98%,98%。RT-PCR结果显示‘无籽瓯柑’Cs RAD51在小孢子母细胞、四分体以及单核花粉粒时期的相对表达量显著高于瓯柑。Cs RAD51的过量表达可能影响了DSBs的同源重组修复,致使‘无籽瓯柑’小孢子母细胞时期减数分裂异常。
【图文】：

电泳图,引物,电泳,瓯柑

录组测序结得到目的条带Cl2法制备大肠眩将阳性克液进行PCR检息学分析通cDNA全长在物种的氨基酸建不同物种间在线工具进行等理化性质；D51克隆与序列00bp的特异性筛选阳性克隆一个1029bp的两次重复性PCR检瓯柑’CsRAD否可用。以Ac使用的定量仪器57℃，30s，Livak）方法计D51基因在瓯表1Table1CAAGAT结果，以‘无籽后的PCR产肠杆菌（DH5克隆菌挑入装有检测，将检测无通过NCBI上的在NCBI和Ph序列，，利用间的系统进化行基因序列编用SOPMA分列分析以性条带（图1菌，送往生工ORF区，编检测，1和2，3图1FigureD51基因的克ctin基因为内器为CFX96T39个循环；计算基因的相瓯柑和‘无籽瓯克隆和RT-PCCloningandRT-PForward（5AGCCATTCCCCGAAGCTGAAAGTCTGCTGGAAG籽瓯柑’cDNA产物进行回收5α）感受态，有1mLLB培无误的阳性克的ORFFindehytozomev12DNAMAN7化树。码的蛋白质分分析预测蛋白‘无籽瓯柑’c）。PCR产物工生物工程（编码342个氨和4分别是同一引物检测电1Resultofprim克隆及在花粉发内参（表1），TMReal-Time65~95℃，相对表达量，利瓯柑’不同发R引物PCRprimer’－3’）CTTTACTAGATGCGGGTGGTGCTGAGA为模板，利收和纯化，并然后通过化培养液的离心克隆菌液送往er工具查找所2.0数据库上进.0进行氨基分析预测；用P白质的二级结cDNA为模板物经回收纯化上海）股份有氨基酸（图2）一对引物的2次重电泳结果merdetection发育过程中的进行CsRADePCRDetecti隔5s上升0利用SPSS16发育时期花药GCATGATGCCAA利用克隆引物并将回收产物化学方法将连接心管中，在

氨基酸序列,核苷酸序列,氨基酸序列,疏水性

4浙江林业科技37卷图2CsRAD51基因的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列Figure2NucleotidesequenceofCsRAD51andthecorrespondingaminoacidsequence使用在线工具ProtParam分析蛋白质的理化性质，CsRAD51基因编码蛋白质分子量为45740.1，氨基酸数为388，原子总数为6555，等电点为10.20；所有氨基酸组成中亮氨酸（Leu）所占比例最高，为18.8%，其次为丝氨酸（Ser），所占比例为10.1%；总的带负电荷残基Asp和Glu为27个，总的带正电荷残基Arg和Lys为60个；蛋白质不稳定指数为51.45%，这种分类的蛋白质是不稳定的。用ProtScale工具分析蛋白的疏水性和亲水性，总平均亲水性（Grandaverageofhydropathicity）为-0.150，第247位异亮氨酸（Ile）亲水性最强（Score：3.400），第42位和第43位天冬酰胺（Asn）疏水性最强（Score：-3.267），蛋白的疏水区明显多于亲水区，表明‘无籽瓯柑’CsRAD51基因编码的蛋白质是一种疏水性蛋白（图3）。用SOPMA方法对CsRAD51基因编码的蛋白质的二级结构进行预测，其结构主要以α螺旋（50.26%）和无规则卷曲（22.94%）为主，此外还有β片层（17.01%）和未知区域（9.79%）（图4）。图3CsRAD51基因编码蛋白疏水性和亲水性分析Figure3AnalysisofhydrophobicityandhydrophilicityofproteinencodedbyCsRAD51位置值数用户序列疏水性分析结果
【作者单位】：浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室;
【基金】：浙江省大学生科技创新活动计划项目(2016R412003) 国家自然科学基金资助项目(31000897) 浙江省团队科技特派员服务计划项目(浙科发农[2013]215-122)
【分类号】：S666.1

【参考文献】