飞蝗几丁质降解酶基因的异质性表达及酶学特性分析
发布时间：2019-09-18 22:51
【摘要】：几丁质是由N-乙酰葡萄糖胺残基通过β-1,4糖苷键连接而成的直连多糖高聚物,主要存在于昆虫的外骨骼、围食膜、肠道和气管以及植物和真菌的细胞壁中,是自然界中仅次于纤维素的第二大生物多聚物。昆虫几丁质降解酶主要分为糖苷水解酶18家族的几丁质酶(Chitinase,Cht)和糖苷水解酶20家族的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(N-Acetylglucosaminidase,NAG)两种,这两种酶通过协同作用可将几丁质降解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。几丁质酶是一种内切酶,可降解几丁质为几丁寡糖,而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是一种外切酶,可将几丁寡糖从非还原端水解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。几丁质降解酶广泛存在于昆虫的中肠、蜕皮液以及一些昆虫的毒腺中,对昆虫生长发育过程中几丁质的代谢起着重要的调控作用。几丁质酶和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作为潜在的杀虫剂靶标、几丁质生物垃圾的降解和生产N-乙酰氨基葡萄糖的酶工具而受到广泛的关注。本研究主要是将飞蝗Ⅰ型几丁质酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(LmNAG1)通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在SF9细胞中进行异质性表达,测定温度和pH对酶活性的影响,以及酶的动力学参数。并通过胶状几丁质结合实验比较LmCht5-1和LmCht5-2对胶状几丁质的结合能力,从而确定几丁质结合结构域(CBD)的功能。主要研究内容分为以下三个部分:一、飞蝗LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达及纯化将飞蝗Ⅰ型几丁质酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(LmNAG1)通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在SF9细胞中进行异质性表达。设计带有酶切位点、起始密码子、终止密码子以及6×His标签的PCR引物扩增目的片段,构建到pFastbacTM Dual真核表达载体上,之后将重组载体转化到DH10感受态细胞中,得到重组Bacmid杆粒,将重组Bacmid杆粒转染SF9细胞进行真核表达。利用6×His标签蛋白与Ni-NTA柱的亲和性对所表达蛋白进行纯化。通过SDS-PAGE胶和Western Blot对纯化后的目的蛋白进行检测。二、飞蝗几丁质降解酶的酶学特性分析获得纯化蛋白后,测定了酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、热稳定性以及酶的动力学参数等。结果显示LmCht5-1和LmCht5-2具有相似的最适pH和温度(使用寡聚底物4MU-(GlcNAc)3时,二者的最适pH值为6,使用多聚底物CM-Chitin-RBV时二者的最适pH值均为9,最适温度为40℃)。使用寡聚底物4MU-(GlcNAc)3测定酶的动力学参数时,LmCht5-1的Km值比LmCht5-2小,LmCht5-1的Kcat/Km值比LmCht5-2大,相反,使用多聚底物CM-Chitin-RBV测定酶的动力学参数时,LmCht5-1的Km值比LmCht5-2大,LmCht5-1的Vmax/Km值比LmCht5-2小,说明LmCht5-1倾向于水解寡聚底物,而LmCht5-2则倾向于水解多聚底物。使用4MU-GlcNAc为底物测定LmNAG1的动力学参数时,LmNAG1的Km值为0.28±0.02mM,kcat/Km值为3215.12±61.98 mM-1S-1,说明LmNAG1酶对底物4MU-GlcNAc有着很高的亲和性,且具有很高的催化效率。所以我们得出结论:在蝗虫体内,LmCht5-1可能主要负责降解寡聚几丁质,LmCht5-2可能主要负责降解多聚几丁质,而LmNAG1主要负责将LmCht5-1和LmCht5-2的降解产物通过外切水解作用降解为N-乙酰氨基葡萄糖单体。三、LmCht5-1和LmCht5-2的几丁质结合特性分析LmCht5-1和LmCht5-2在结构上都具有信号肽、一个催化域和一个连接区,此外LmCht5-1比LmCht5-2多一个CBD区(Chitin binding domain)。本研究通过Arakane等[1]所描述的几丁质结合特性研究方法对飞蝗几丁质酶LmCht5-1和LmCht5-2的几丁质结合特性进行了研究,得出结论:含有CBD区的LmCht5-1可以和胶状几丁质紧密结合,而不含CBD区的LmCht5-2则几乎不能结合胶状几丁质。本研究首次将飞蝗Ⅰ型几丁质酶(LmCht5-1和LmCht5-2)和β-N-乙酰葡萄糖苷酶(LmNAG1)构建于真核表达载体上进行表达和纯化,并对纯化蛋白进行了最适pH、pH稳定性、最适温度、热稳定性以及酶反应动力学参数的测定。进一步明确了LmCht5-1、LmCht5-2和LmNAG1的理化特性,为利用几丁质降解酶进行害虫防治提供了理论依据。
【图文】：
－逦」ｎ逡逑图１－１几下质的化学结构逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃ化ｉ＊ｅ邋ｏｆ邋ｃｈｉｔｉｎ逡逑几Ｔ质又名壳多糖，是由Ｎ－己憸葡萄糖胺残基通过ｐ－ｌ，４糖昔键连接而成的逡逑直连多糖高聚物（图１－１），是自然界含量仅次与纤维素的第二大生物高聚物逡逑几Ｔ质广泛存在于线虫的卵壁、真菌的细胞壁、节肢动物的外骨骼及围食膜中Ｐ’逡逑１逡逑
修饰Ｗ及配子结合，在脊椎动物中参与糖复合物代谢。逡逑通过对昆虫的Ｐ－Ｎ－乙憸葡萄糖昔酶（ＮＡＧｓ）进行系统进化分析，可将Ｐ－Ｎ－逡逑己憸葡萄糖昔酶分为五大类［ｗ］（图１－３）：逡逑Ｉ型ＮＡＧ酶：飞蜡ＬｍＮＡＧｌ属于这一类型的水解酶，该类酶主要参与几逡逑Ｔ质降解过程。逡逑ＩＩ型ＮＡＧ酶：该类酶与Ｉ型ＮＡＧ酶的功能类似，具有几Ｔ质降解活性。逡逑ＩＩＩ型ＮＡＧ酶：该类酶主要负责糖复合物代谢、配子结合Ｗ及Ｎ－糖基化修饰逡逑等。逡逑ＩＶ型ＮＡＧ酶：该类型酶又称为（３－Ｎ－乙憸己糖胺酶（Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｓ，ＨＥＸｓ），逡逑主要负责几Ｔ质中Ｐ－糖巧键连接的Ｐ－Ｎ－乙憸半s前泛停校危覒溒咸烟前返乃义辖狻ｅ义希中停危粒敲福焊美嗝赣直怀莆ǎ常危溎谇邪被咸烟俏裘稿义希ǎ澹睿洌铮校危幔悖澹簦欤纾欤酰悖铮螅幔恚椋睿椋洌幔螅澹澹牛危牵螅哂心谇兴饷富钚浴ｅ义希危粒侵饕斡胧抢コ婕噶酥实慕到猓矣凶藕芮康奈镏痔匾煨裕卓慑义希欤椋铃澹危粒俏ケ晟杓婆┮├唇泻Τ娣乐巍Ｍü噶酥拭负停危粒切饔每刹义仙糜诠枪亟谘住⒎缡怨亟谘字瘟坪褪称诽砑蛹恋模危簯湴被咸翘堑ヌ澹义辖薮蟮木眯б妗ｅ义希村义
本文编号：2537760
【图文】：
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修饰Ｗ及配子结合，在脊椎动物中参与糖复合物代谢。逡逑通过对昆虫的Ｐ－Ｎ－乙憸葡萄糖昔酶（ＮＡＧｓ）进行系统进化分析，可将Ｐ－Ｎ－逡逑己憸葡萄糖昔酶分为五大类［ｗ］（图１－３）：逡逑Ｉ型ＮＡＧ酶：飞蜡ＬｍＮＡＧｌ属于这一类型的水解酶，该类酶主要参与几逡逑Ｔ质降解过程。逡逑ＩＩ型ＮＡＧ酶：该类酶与Ｉ型ＮＡＧ酶的功能类似，具有几Ｔ质降解活性。逡逑ＩＩＩ型ＮＡＧ酶：该类酶主要负责糖复合物代谢、配子结合Ｗ及Ｎ－糖基化修饰逡逑等。逡逑ＩＶ型ＮＡＧ酶：该类型酶又称为（３－Ｎ－乙憸己糖胺酶（Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅｓ，ＨＥＸｓ），逡逑主要负责几Ｔ质中Ｐ－糖巧键连接的Ｐ－Ｎ－乙憸半s前泛停校危覒溒咸烟前返乃义辖狻ｅ义希中停危粒敲福焊美嗝赣直怀莆ǎ常危溎谇邪被咸烟俏裘稿义希ǎ澹睿洌铮校危幔悖澹簦欤纾欤酰悖铮螅幔恚椋睿椋洌幔螅澹澹牛危牵螅哂心谇兴饷富钚浴ｅ义希危粒侵饕斡胧抢コ婕噶酥实慕到猓矣凶藕芮康奈镏痔匾煨裕卓慑义希欤椋铃澹危粒俏ケ晟杓婆┮├唇泻Τ娣乐巍Ｍü噶酥拭负停危粒切饔每刹义仙糜诠枪亟谘住⒎缡怨亟谘字瘟坪褪称诽砑蛹恋模危簯湴被咸翘堑ヌ澹义辖薮蟮木眯б妗ｅ义希村义
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