骨保护素基因多态性及骨质疏松性骨折的研究

发布时间：2019-09-23 10:16

【摘要】：骨质疏松(Osteoporosis, OP)的主要表现为骨密度(bone mineral density, BMD)降低,骨皮质较正王常变薄,骨小梁数目少于平常水平,骨髓腔扩大,容易导致骨质疏松性骨折。骨质疏松性骨折临床上以脊柱椎体压缩性骨折,桡骨远端骨折等多见,引起驼背,身体缩短以及呼吸系统的疾病,常常需要较长时间卧床修养,严重影响病人的生活质量,甚至并发褥疮,肺内感染,泌尿系感染等疾病,威胁患者的生命,故亟需进一步研究骨质疏松的发病机制以及骨质疏松性骨折的愈合机制。针对以上问题,本文将研究了骨保护素(osteoprotegerin, OPG)遗传多态性与骨矿物质密度(bone mineral density, BMD)和骨质疏松的相关性,OPG基因突变对蛋白表达和生物活性的影响及其影响破骨细胞分化成熟的信号转导机制,以期进一步了解骨质疏松的发病机制,研究了骨质疏松性骨折与血清神经生长因子相关性,并探讨了神经生长因子促进骨质疏松性骨折愈合的可能机制,为骨质疏松及其骨质疏松性骨折的治疗提供支持。具体的研究包括以下几个方面：(1)研究了骨保护素基因g.27563GA遗传多态性与绝经女性骨密度关系的问题。骨质疏松的主要表现为骨密度降低,骨小梁的数目减少,骨皮质变薄,髓腔增宽,容易导致骨质疏松性骨折。研究纳入435名绝经后骨质疏松女性和442名年龄相仿的健康女性为对照进行病例对照研究。用美国NORLAND公司XR-46型双能X线骨密度仪评估髋股骨颈、腰椎(L24)和全髋关节骨矿物质密度。应用创造酶切位点聚合酶链式反应(CRS-PCR)和DNA测序方法检测g.27563GA骨保护素遗传多态性基因型。我们发现g.27563GA骨保护素遗传多态性为错义突变,导致了精氨酸(Arg)至谷氨酰胺(Gln)的氨基酸(p.Arg333Gln)置换。骨保护素g.27563GA遗传多态性基因型髋股骨颈、腰椎(L2-4)和全髋关节骨矿物质密度明显不同。GG基因型的骨矿物质密度值明显高于其他基因型GA和从(P0.05),故认为骨保护素g.27563GA基因遗传多态性A等位基因可能与绝经后女性骨矿物质密度值低相关,从而增加骨质疏松发生的危险。(2)研究了OPG基因突变对蛋白表达和生物活性的影响。我们通过CRS-PCR方法在OPG基因第5外显子发现g.27563GA基因遗传多态性,随后分析了该遗传多态性与BMD和骨质疏松的潜在关系。结果显示中国绝经期女性骨密度和骨质疏松与遗传多态性有显著相关性。然而,OPG的基因多态性与骨质疏松之间的具体联系并不清楚。故本部分在成功构建体外过表达野生型和突变型OPG基因的细胞培养体系的基础上,研究突变对OPG的.蛋白表达和活性影响。结果表明基因突变不能影响OPG的蛋白表达水平,但是能够抑制其正常活性。(3)研究了OPG基因突变影响破骨细胞分化成熟的信号转导机制。我们观察了野生型和突变型OPG基因所表达的蛋白在破骨细胞的分化与活化功能上是否存在差异。结果表明野生型OPG能够抑制破骨细胞的分化,而突变型的OPG抑制作用显著低于野生型。然而,具体作用机制仍不清楚,需要进一步研究。破骨细胞从起源发育至成熟,再经活化发挥吸收作用是一个复杂的多级调控过程,介导破骨细胞分化成熟的信号传导路径主要包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)、核转录因子kappa B (NF-κB)和钙调磷酸酶／活化T细胞核因子(CN/NFAT)等通路。本章内容将研究OPG基因突变能否影响破骨细胞分化过程中MAPK信号通路和Ca2+信号通路。(4)研究了骨质疏松性骨折与血清神经生长因子相关性的问题。骨质疏松症最大的危害是导致骨折。骨强度降低导致骨质疏松性骨折,由于属于脆性骨折,所以轻微的损伤如摔倒、扭伤等即可发生骨质疏松性骨折常发生于桡骨(远端骨折)、肱骨(近端骨折)、脊椎(胸腰段)。研究纳入102名绝经后骨质疏松性骨折女性,102名绝经后骨质疏松女性和102名年龄相仿的健康女性,进行病例对照研究。所有入选对象均抽取空静脉血 5m1,采用双抗体夹心固相酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清神经生长因子(NGF)水平,发现骨质疏松及骨质疏松性骨折患者与年龄相仿的健康女性相比,血清NGF水平下降(P0.05),说明NGF水平下降可能是导致骨质疏松和骨质疏松性骨折的因素。(5)研究了探讨神经生长因子(nerve growth factor, NGF)对兔骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)表达的影响。健康新西兰大耳白兔108只,制备标准的兔右侧桡骨骨折模型,A组采用肌肉注射NGF1周,200ng/Kg/次,一日二次；B组采用腹腔注射NGF抗体三周,400ng/次,一日三次,C组注射生理盐水三周,1ml/次,一日二次。进行BMP蛋白Western免疫印记分析,Gel Doc2000图像分析,发现在各个时相点,NGF组比抗NGF抗体组、对照组诱导骨组织内BMP表达量多,且NGF组骨组织中BMP表达时间延长,高峰浓度提前、下降缓慢(P0.05)。说明神经生长因子促进骨折愈合的机制可能是：通过促进骨折愈合过程中BMP的表达促进骨折愈合。(6)研究了神经生长因子对兔骨折愈合过程中血管内皮生长因子表达的影响。建立标准兔桡骨骨折模型,分别用神经生长因子、神经生长因子单克隆抗体和生理盐水进行干预,用Western blot免疫印迹分析方法检测损伤后24,48h和损伤后1,3,6,8周,骨折端组织血管内皮生长因子蛋白的表达,发现3组各时间点血管内皮生长因子表达的关系为：应用神经生长因子组对照组拮抗神经生长因子组(P0.05)。说明在骨折愈合过程当中,应用神经生长因子可以促进血管内皮生长因子表达。通过上述研究,发现骨保护素g.27563GA基因遗传多态性A等位基因可能与中国绝经后女性骨矿物质密度值低相关,从而增加骨质疏松发生的危险。进一步研究发现OPG基因突变虽然不影响OPG蛋白表达水平,但能够抑制其正常活性,对破骨细胞分化的影响与p38和JNK信号通路有密切联系。神经系统与骨组织密切相关,可能通过神经递质、外周神经突触以及激素共同调控骨的正王常代谢及骨折修复。在后3部分研究中,我们首次发现血清神经生长因子的水平与骨疏松及骨质疏松性骨折具有明显相关性,提示血清神经生长因子水平的下降,可能导致骨质疏松及骨质疏松性骨折,为骨质疏松及骨质疏松性骨折的研究开启了全新的视角。神经生长因子促进骨折愈合的机制可能是在骨折愈合过程中,通过促进BMP和VEGF的表达实现,提示NGF可以在骨质疏松和骨质疏松性骨折的防治中,起到重要的作用。
【图文】：

基本资料,骨矿物质密度,基因型,基因多态性

２．２．３邋ＯＰＧ基因多态性和ＢＭＤ关联性分析逡逑骨质疏松患者组和健废对照组ｇ．２７％３Ｇ＞Ａ基因多态性特征见表３，包括年龄、体逡逑重、身高、体重质数，髓股骨颈，脊柱和全髓关节骨矿物质密度（图２．１）。结果显示不同逡逑基因型髓股骨颈，巧柱和全髓关巧骨矿物质密度有思著性差异，，ＧＧ基因型骨密度值较逡逑ＧＡ和ＡＡ基因型高（Ｐ＜０．０＾邋（表２．３）。逡逑Ｓａｍｐｌｅ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｆｎ邋ｔｈｅ邋３邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑§邋１逦逡逑巧ＧＧ逡逑ａ邋ＧＡ逡逑曼逦耐逦逦ｙ．逡逑ｔ．逦？逡逑TB逦逦逦逡逑１逡逑｜Ｉ｜邋工巧■邋ｒＭｌ＊逡逑ｓ逦画逦醒逡逑Ａｇｅ逦Ｈｅｉｇｈｔ逦Ｗｅｉｇｈｔ逦己邋Ｍｌ逦？逡逑■逡逑图２．邋１不同基因型女性患者组基本资料比较逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１逦Ｃｈａｒａｃ化ｒｉｓｔｉｃｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑１９逡逑

表达水平,蛋白,表达质粒

平的可能性进行探讨，建立了巧变型ＯＰＧ表达质粒，然后稳定转染至ＨＥＫ２９３细胞。逡逑野生型和突变型的ＯＰＧｍＲＮＡ和蛋白表达水平分别使用Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ半定量ＰＣ民和逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ进行检测。如图３．１所示，ＯＰＧ表达质粒的细胞被转染后，ＯＰＧｍＲＮＡ逡逑和蛋白表达水平均上升，然而，ＨＥＫ２９３细胞系中的基因突变不影响ＯＰＧｍＲＮＡ和蛋白逡逑表达水平。因此，本研究认为基因巧变对ＯＰＧ的表达水平无调节作用。逡逑２７逡逑
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580;R683

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