一种多重PCR技术在转基因大豆检测中的应用研究

发布时间：2019-09-26 03:23

【摘要】：目的:本课题利用公共引物介导的多重PCR技术(Universal primer-multiplex polymerase chain reaction,UP-MPCR),以我国批准进口(已经颁发了安全证书)的12种转基因大豆中转基因序列为基因检测靶标,建立一种低成本、高特异性和高效的多重PCR方法体系,研发适用于加工食品中转基因大豆成分鉴定的核酸检测试剂盒。方法:本课题包括设计引物、构建质粒模板、建立多重检测体系、多重体系检测。本课题中设计引物包括公共引物、特异引物和嵌合引物。公共引物设计原则:长度17~20bp、GC%含量合适、无重复序列、引物间无二聚体和发卡结构等,经过Blast比对修改后,要求与以转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA为模板扩增无特异性产物,再以转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA为模板进行PCR实验验证,筛选公共引物。将筛选出的3条公共引物通过PCR连接到一段大豆Lectin基因序列两端,插入质粒载体中构建重组质粒,经过测序验证后,将阳性重组质粒梯度稀释作为模板,用公共引物进行扩增,检测各公共引物扩增的敏感性。通过文献、数据库和专利等搜索获得这12种转基因大豆(MON87701、GTS40-3-2、MON89788、CV127、A2704、A5547、DP356043、DP305423、MON87769、MON87708、305423×40-3-2、MON87701×MON89788,其中有两种为复合性状转基因大豆)插入序列和5’、3’侧翼序列,采用品系特异性检测方法,在转基因大豆插入序列与大豆基因组的5’或3’侧翼连接区域设计引物,比对引物,同时进行多重引物比对。将筛选出的公共引物连接在特异引物的5’端构成嵌合引物,将多对嵌合引物通过以上同样的方法进行比对获得最佳嵌合引物,通过PCR实验验证其特异性及敏感性。本课题目的是构建一个同时检测12种转基因大豆的多重检测体系,本体系的建立包括单对嵌合引物的特异性检测、确定扩增体系和反应条件、多重检测体系的特异性和敏感性检测。本体系采用两步温度法,前10个循环采用高退火温度(61℃),后30个循环采用低退火温度(54℃)。将10种转基因大豆的部分靶序列和部分大豆Lectin序列,通过不同的分子克隆方法构建了4个重组质粒阳性模板,包括含有4个目的片段的pSOYG1、含有5条目的片段的pSOYG2和2个只含有1条目的片段的重组质粒模板。结果:本课题成功设计并成功筛选出了3条公共引物,与转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA扩增无影响结果判断的特异性产物,且公共引物敏感性达到100个拷贝。本课题针对12种转基因大豆和大豆内参基因Lectin构建了2个分别含有4个或5个目的片段的阳性重组质粒模板pSOYG1和pSOYG2、2个只含有单个插入片段的阳性质粒模板。其中pSOYG1含有4条目的片段,4条目的片段分别对应转基因大豆MON87701、GTS 40-3-2、MON89788和内参基因Lectin;pSOYG2含有5条目的片段,5条目的片段分别对应转基因大豆A2704-12、DP356043、DP305423、CV-127、A5547-127;2个只含有单个插入片段的阳性质粒模板,分别对应转基因大豆MON87708、MON87769。本课题构建了用于12种转基因大豆核酸检测的公共引物介导的多重PCR检测体系(UP-MPCR),采用了品系特异性检测方法,具有高特异性和高敏感性。本体系敏感性达到了0.1ng,即0.1%(0.1ng/100 ng样品DNA)。结论:本课题构建的公共引物介导的多重PCR(UP-MPCR)检测体系对12种转基因大豆的核酸检测具有较高的敏感性和特异性。该方法准确、高效和经济,同时,为本检测方法推广应用于如西红柿、玉米、土豆等众多其它转基因食品的基因检测提供参考资料和示范。
【图文】：

流程图,流程

公共引物设计筛选流程

序列,序列,片段,目的

含公共引物序列目的片段结构示意图
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.1;Q943.2

【参考文献】