DACT1基因不同区域异常甲基化对食管鳞癌患者预后的影响

发布时间：2019-09-28 12:46

【摘要】：目的:检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)组织标本及细胞株中β-环连蛋白抑制基因1(dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 1,DACT1)Cp G岛旁区域及转录起始点(transcription start site,TSS)区域的甲基化状态,并进一步探讨DACT1基因两个不同区域甲基化状态对基因转录及预后的影响。方法:应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)及RT-PCR的方法检测ESCC细胞株(TE1、TE13、T.Tn和Eca109)及河北省上消化道肿瘤高发区159例ESCC患者癌及相应癌旁组织中DACT1基因两个不同区域的甲基化状态及m RNA的表达情况。结果:DACT1基因在4株ESCC细胞系中均呈弱表达或阴性表达。应用甲基化抑制剂5-Aza-Dc处理该细胞株后,DACT1 m RNA表达明显增强;同时,MSP检测结果显示,此两区域的甲基化条带均明显减弱或消失;而应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理细胞株后,该基因在各细胞株中的表达无明显改变。DACT1 m RNA在ESCC组织中的表达较癌旁组织明显下调(P0.01),且与该基因TSS区域异常甲基化状态有关(P0.01);DACT1基因Cp G岛旁区域的甲基化频率在癌及相应癌旁组织中均较高(P0.05),不具有肿瘤组织特异性,且对DACT1基因的转录抑制无明显影响(P0.05);生存分析显示,DACT1基因TSS区域的甲基化状态与ESCC癌患者的生存期相关(P0.01)。结论:ESCC中DACT1基因TSS区域的异常高甲基化状态是引起其表达下调的机制之一,并有望作为ESCC患者预后的甲基化标志物。
【图文】：

异常甲基化对食管癌患者预后的影响岛旁区域，即位于CpG岛边缘CpG位点密度相对较低的区域（region1：-540~-419bp）和环绕转录起始点TSS区域（region2：-16~105bp）（图1）甲基化。MSP引物序列及PCR条件见表1。MSP法检测ESCC及癌旁组织和食管癌细胞株的DACT1基因甲基化状态。SssI处理基因组DNA作为甲基化阳性对照（M-PC)组，无消化系统及其他系统肿瘤的正常人外周血DNA作为非甲基化阳性对照(N-PC)组，，灭菌双蒸水取代DNA模板进行PCR作为阴性对照(NC)组。随机选取10%标本进行重复实验。+1:Thetranscriptionstartpoint图1DACT1基因启动子区CpG岛分布图Fig.1DistributionoftheCpGislandsinpromoterofDACT1gene1.5RT-PCR方法检测DACT1mRNA表达按TRIzol试剂盒说明书提取组织及细胞株总RNA，参照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，用于检测DACT1mRNA的表达。GAPDH作为内参照，所用引物及退火温度见表1。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，利用图像分析系统Gelwork-2ID对mRNA进行定量。1.6免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法检测DACT1蛋白表达应用常规SP法。石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇水化。3%甲醇过氧化氢封闭后用EDTA高压修复2~5min，血清封闭，DACT1抗体孵育过夜，再依次加入生物素化二抗及辣根过氧化物酶标记的三抗，DAB显色，苏木精复染。以PBS代替一抗做空白对照。以胞浆内出现均匀一致的棕黄色颗粒视为阳性表达，并依据传统的染色评分方法[7]对结果进行判定。1.7统计学处理数据统计分析采用SPSS19.0统计学软件。各组间甲基化频率差异分析用χ2检验；mRNA表达数据用表示，差异比较用t检验；用Log-rank检验分析DACT1基因CpG岛旁区域和TSS区域甲基化状态对ESCC患者生存期的影响。P<0.05或P<0.01表示差?

异常甲基化对食管癌患者预后的影响岛旁区域，即位于CpG岛边缘CpG位点密度相对较低的区域（region1：-540~-419bp）和环绕转录起始点TSS区域（region2：-16~105bp）（图1）甲基化。MSP引物序列及PCR条件见表1。MSP法检测ESCC及癌旁组织和食管癌细胞株的DACT1基因甲基化状态。SssI处理基因组DNA作为甲基化阳性对照（M-PC)组，无消化系统及其他系统肿瘤的正常人外周血DNA作为非甲基化阳性对照(N-PC)组，灭菌双蒸水取代DNA模板进行PCR作为阴性对照(NC)组。随机选取10%标本进行重复实验。+1:Thetranscriptionstartpoint图1DACT1基因启动子区CpG岛分布图Fig.1DistributionoftheCpGislandsinpromoterofDACT1gene1.5RT-PCR方法检测DACT1mRNA表达按TRIzol试剂盒说明书提取组织及细胞株总RNA，参照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，用于检测DACT1mRNA的表达。GAPDH作为内参照，所用引物及退火温度见表1。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，利用图像分析系统Gelwork-2ID对mRNA进行定量。1.6免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法检测DACT1蛋白表达应用常规SP法。石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇水化。3%甲醇过氧化氢封闭后用EDTA高压修复2~5min，血清封闭，DACT1抗体孵育过夜，再依次加入生物素化二抗及辣根过氧化物酶标记的三抗，DAB显色，苏木精复染。以PBS代替一抗做空白对照。以胞浆内出现均匀一致的棕黄色颗粒视为阳性表达，并依据传统的染色评分方法[7]对结果进行判定。1.7统计学处理数据统计分析采用SPSS19.0统计学软件。各组间甲基化频率差异分析用χ2检验；mRNA表达数据用表示，差异比较用t检验；用Log-rank检验分析DACT1基因CpG岛旁区域和TSS区域甲基化状态对ESCC患者生存期的影响。P<0.05或P<0.01表示差?
【作者单位】： 河北医科大学第四医院河北省肿瘤研究所病理研究室;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(No.81472335,No.81572441) 河北省自然科学基金资助项目(No.H2013206315)~~
【分类号】：R735.1

【参考文献】

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【共引文献】

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【二级参考文献】

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本文编号：2543332