小麦BR合成基因TaDWF4的鉴定与功能分析

发布时间：2019-09-30 07:57

【摘要】：小麦是世界上重要的粮食作物之一,它的生产直接影响着全球的粮食安全。小麦能够提供人类20%的热量和蛋白质,同时也是我国的第二大粮食作物。油菜素类固醇(Brassinosteroids,BR)是重要的植物生长激素,在植物生长发育的各个阶段发挥着重要的作用。目前对BR合成的调控机理及其对植物生长发育影响的研究主要在水稻、拟南芥中,而在重要的粮食作物小麦中鲜有报道。DWF4在BR合成路径中是一个关键的限速酶基因。为了解DWF4基因在小麦生长发育过程中的作用,本研究以同源搜索的方式从小麦中克隆得到的与拟南芥BR合成路径中的关键合成基因AtDWF4同源的基因为对象,命名为TaDWF4,同时存在反馈抑制现象,构建由35S驱动的TaDWF4超表达载体35S::TaDWF4,农杆菌转化拟南芥,获得多个TaDWF4转基因拟南芥植株,观察拟南芥表型的差异。得到以下主要结论:1.以拟南芥AtDWF4在小麦基因数据库中进行同源搜索,通过进化树分析、结构域分析、转录组数据分析和序列完整度分析,最终确定小麦BR合成基因TaDWF4是Traes_4AS_C318715F9.1和Traes_4BL_BAFA18B1D.1。2.通过实时定量PCR检测,当外施高浓度BR后,小麦TaDWF4基因的表达量就会显著降低,说明小麦TaDWF4存在BR反馈抑制现象。3.采用Gateway体外重组技术进行小麦TaDWF4基因的克隆,克隆结果显示,Traes_4BL_BAFA18B1D.1测序结果与小麦数据库提供序列一致,而Traes_4AS_C318715F9.1在426位测序少了一个氨基酸谷氨酰胺Gln,因此我们认为小麦数据库提供的Traes_4AS_C318715F9.1基因序列是有误的,正确的氨基酸序列应该是缺少谷氨酰胺的。4.将构建好的TaDWF4基因超表达载体35S::TaDWF4转农杆菌感受态GV3101中,农杆菌侵染拟南芥Col、Ws2、杂合dwf4-44和bri1-5。经除草剂筛选和目的基因PCR鉴定,共得到转基因植株337株。5.观察转基因阳性植株的表型发现,小麦TaDWF4基因转野生型Col、Ws2和dwf4-44突变体后,与转基因背景相比,植株都表现为叶柄明显变长,同时叶形也发生了变化,莲座叶的长度和宽度均减少,长宽比变大,叶面积变小,且莲座叶两侧向内卷曲。小麦TaDWF4基因在bri1-5中超表达后使bri1-5突变体表型得以部分恢复,超表达植株叶柄明显变长,同时莲座叶叶形也发生变化,莲座叶卷曲程度下降,且长宽比变大,这与超表达拟南芥AtDWF4基因在bri1-5突变体的表型是一致的。6.综上可知,在本研究中所筛选到的两个基因与拟南芥中的At DWF4基因功能相似,确定其为小麦中BR合成过程中的关键限速酶基因。研究结果表明,在小麦中至少存在两个具有DWF4功能的基因。
【图文】：

序列,结构域,拟南芥,氨基酸

能够有效地调控植物体内 BR 的生物合成水平。AtDWF4 蛋白包含 5氨基酸，其中 400 多个氨基酸为细胞色素 P450 氧化酶的结构域（图 3-1），将 AtDW基酸序列递交至在线结构域预测工具 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）即到结构域。其氨基酸下列如下：AT3G50660.1FETEHHTLLPLLLLPSLLSLLLFLILLKRRNRKTRFNLPPGKSGWPFLGETIGYLKPYTTLGDFMQQHVSKYGKIYRSNLFGEPTIVSADAGLNRFILQNEGRLFECSYPRSIGGGKWSMLVLVGDMHRDMRSISLNFLSHARLRTILLKDVERHTLFVLDSWQQNSIFSDEAKKFTFNLMAKHIMSMDPGEEETEQLKKEYVTFMKGVVSAPLNLPGTAYHKASRATILKFIERKMEERKLDIKEEDQEEEEVKTEDEAEMSKSDHVRKQRTDDDLLGWLKHSNLSTEQILDLILSLLFAGHETSSVAIALAIFFLQACPKAVEELREEHLEIARAKKGESELNWDDYKKMDFTQCVINETLRLGNVVRFLHRKALKDVRYKGYDIPSGWKVVISAVHLDNSRYDQPNLFNPWRWQQQNNGASSSGSGSFSTWGNNYMPFGGGPRLGSELAKLEMAVFIHHLVLKFNWELAEDDKPFAFPFVDFPNGLPIRVSRIL*

完整度,序列,基因,小麦

0小麦 BR 合成基因 TaDWF4 的鉴定与功能研究表明，如果某个基因在植物生长发育过程中发挥重平相对来说是较高的。所以进一步根据基因表达水平来筛因。对照本实验室已有的小麦转录组数据，分析这 9 个候（图 3-3），，发现位于 4 号染色体上的候选基因转录水平表色体上的候选基因表达量都较少，有的候选基因甚至没有确定小麦TaDWF4基因位于4号染色体上。同时对候选基因-4），Traes_4BL_BAFA18B1D.1 基因和 Traes_4AS_C318715raes_4DL_3A16689F6.1 基因序列不完整，无法进行后续试色体上的基因 Traes_4BL_BAFA18B1D.1 和 Traes_4AS_C因。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S512.1

【参考文献】