大肠杆菌基因工程菌转化半纤维素水解液生产木糖醇的研究

发布时间：2019-10-12 15:29

【摘要】：木糖醇是一种五碳糖醇,具有抗龋齿、代谢不依赖胰岛素、改善肝功能等特点,广泛应用于食品、医药和化工等行业。当前工业上生产木糖醇主要是利用半纤维素水解液中分离纯化获得的纯木糖,在高温高压条件下使用镍催化加氢制得,这种工艺条件苛刻、容易造成污染、生产成本较高。生物法生产木糖醇不需要高温高压条件、污染环境的镍和高纯度木糖等,所以生物法生产木糖醇越来越受到人们的重视。大肠杆菌作为生产各种高附加值化学品的理想宿主,其具有培养条件简单、能够利用半纤维素水解液中所有糖类、生长速度快、基因操作简便、蛋白表达水平高等诸多优点。目前,以大肠杆菌为宿主利用半纤维素水解液生产木糖醇的研究已有报道,但其生产效率低且成本较高,和化学法相比还不具备优势。本论文以大肠杆菌W3110为宿主细胞,针对目前基因工程菌生产木糖醇存在的问题,主要围绕以下四个方面进行了研究：1)在较高温度下蛋白的高效可溶表达；2)目的基因在宿主菌中遗传稳定性；3)生产过程中副产物阿拉伯糖醇的消除；4)工业应用中培养基的廉价化。首先,为了解决在较高温度下蛋白可溶表达问题,我们基于质粒载体系统构建了第一代高产木糖醇菌株。利用质粒载体进行蛋白的表达,通过mRNA二级结构的调节,构建了一个能在较高温度下高效可溶表达的质粒；在30℃条件下,酶活是出发菌株的5.68倍。通过敲除葡萄糖磷酸转移酶系统中酶Ⅱ组分的ptsG基因,消除菌株的代谢物阻遏效应,使菌株能同时转运葡萄糖和木糖；敲除菌株自身代谢木糖的基因xylA和xylB,阻断木糖的代谢利用；敲除可转运木糖醇的果糖磷酸转移酶系统中酶Ⅱ组分的ptsF基因,减少木糖醇的磷酸化；通过一系列的优化,木糖醇生产效率是出发菌株的8.71倍。在实验室小试中,工程菌利用纯木糖进行补料分批发酵,产生了172.4 g L-1的木糖醇,生产效率为1.57 g L-1h-1,相对于葡萄糖的摩尔得率达到2.2；利用半纤维素水解液生产木糖醇时,产物浓度和生产效率分别达到150gL-1和1.40 gL-1h-1。接着,为了解决使用质粒系统带来的菌株遗传不稳定的问题,我们建立了一套基因组多拷贝整合系统RecA-assisted chromosomal integration (RACI),使xr基因以特定拷贝数整合进大肠杆菌的基因组；整个整合系统的核心是构建一个含有IS5序列、R6K复制子、P43启动子和xr基因的载体；利用IS5序列作为整合位点进行大肠杆菌基因组多拷贝整合,目的基因能在菌株内稳定遗传。利用该系统,我们构建了一株基因组中存在4个拷贝xr的菌株。工程菌利用纯木糖进行分批发酵时,产生了110.1 g L-1木糖醇,生产效率为3.06 g L-1h-1,此生产效率和使用多拷贝质粒菌株的生产效率大致相当,但其优点是不需要额外添加抗生素和诱导剂,降低了生产成本。进一步,为了解决木糖醇生产过程中副产物阿拉伯糖醇的问题,我们对木糖还原酶进行了定点突变,提高其对木糖的选择性,获得了一个对阿拉伯糖活性降低了27倍的突变体。在摇瓶发酵中,含有此突变体的菌株在使用质粒作为表达载体时,在产物中已检测不到阿拉伯糖醇的存在；但在发酵罐发酵中仍有47.34%的阿拉伯糖转化成阿拉伯糖醇。我们发现使用整合型菌株(木糖还原酶酶活较低),可以显著降低阿拉伯糖醇的产生,只有9.6%的阿拉伯糖转化成阿拉伯糖醇。使用含有突变酶的整合型菌株在发酵罐中转化半纤维素水解液生产木糖醇时,在产物中已检测不到阿拉伯糖醇。最后,为了使本工艺实现产业化,获得符合产业化需要的培养基组成,我们选择工业级玉米浆干粉作为氮源,工业级葡萄糖作为碳源,半纤维素水解液作为底物,对生产条件进行了优化。考察了温度对酶活和木糖醇生产效率的影响,确定了菌株在30℃条件下,木糖醇的生产效率最高；经过摇瓶水平的发酵条件优化,确定了最佳底物浓度为20g L-1,最佳底物添加时机为菌株培养4小时后添加。进行补料分批发酵时,工程菌产生了143.8 gL-1的木糖醇,生产效率为1.84gL-1h-1。总之,通过本论文的系统研究,实现了重组大肠杆菌利用廉价培养基转化半纤维素水解液生产高纯度木糖醇,为木糖醇的工业化生产奠定了坚实的基础。
【图文】：

阿拉伯糖,大肠杆菌,机制,效应

有待更深入的研究。逡逑虽然大部分微生物的ＣＣ民效应的机制还是未知的，但作为模式微生物，大逡逑肠巧菌和妆覃芽泡杆菌，特别是大肠杆菌有过广泛的研究（图１．４），相比较于逡逑其它微生物，大肠杆菌是利用生物质资源生产化学品的最理想菌株，因为其可ＬＸ逡逑利用生物质资源中的所有糖类、基因操作简单、生长速度快、易于培养。在大肠逡逑杆菌中葡荀糖、木糖和阿拉伯糖分别通过裤酸转移酶系统（ＰＴＳ）、Ｘｙｌｔ（ＸｙｌＦＧＨ，逡逑ＸｙｌＥ）和Ａｒａｔ（ＡｒａＦＧＨ，ＡｒａＥ）进行转运。负责木糖和阿拉伯糖转运、代谢的基逡逑因的转录需要转录激活因子ＸｙｌＲ和ＡｒａＣ，并且它们的功能需要相关糖类激活；逡逑转录激活园子与相应糖类结合后会与其后动子区域结合，启动相应基因的转录。逡逑非ＰＴＳ系统糖类的转运会受到菊萄糖ＰＴＳ系统的抑制，转录激活因子缺失诱导逡逑剂，导致相应代谢基因不能够后动转录口８，５９］；这是由于在荀萄糖存在时，去蝶暖逡逑化的ＥＩＩＡＧＩ。水平升高

木糖,阿拉伯,微生物细胞,代谢途径

在解决了同时利用混合糖的问题么后，如何提高木糖的利用与木糖醇的生产逡逑效率化有过大量的巧究工作。由于木糖的还原是木糖醇生产的唯一步骤，木糖还逡逑原酶在木糖醇的生物合成中就显得尤为重要了（如图１．５）。目前，有多种木糖逡逑还原醇被发现，并进行了克隆和异源表这，但大多数酶的催化活性并不高，所Ｗ逡逑寻找催化活性更高的酶或者通过定向进化提高木糖还原酶的澊活，对于提高木糖逡逑醇的生产效率是一个有效手段ＰＷ。由于木糖还原酶绝大部分都是从真核徵生物逡逑中发现的，在进行异源表运时经过密码子优化可Ｗ提高菌株的活性和木糖醇的产逡逑量［４２］。另一方面，由于绝大多数木糖还原酶选择性不高，对多种己糖和戍糖都有逡逑催化活性，，特别是阿拉伯糖，其是木糖的同分异构体，是半纤维素水解液中仅次逡逑于未糖的单糖；其可ＬNB被木糖还原酶催化还原成副产物阿拉伯糖醇。半纤维素水逡逑解液中阿拉伯糖的去除和产物中阿拉伯糖醇的分离是非常困难的，必然会导致较逡逑高的生产成本。为了提高木糖还原酶的选择性，通过定向进化获得了一个木糖还逡逑原酶突变体
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ353

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