VEGF111b基因治疗促进皮肤创面愈合的在体研究

发布时间：2019-10-17 17:07

【摘要】：研究背景：血管内皮生长因子A (Vascular endothelial growth factor A, VEGF)在生理和病理血管化中均发挥着关键作用。人VEGF基因位于染色体6p21.3,由8个外显子构成,其中第6、7和8外显子具有有近端剪接位点和远端剪接位点,并因5’和3'端剪接位点的选择性差异产生了多种形式的VEGF剪接变异体。根据第8外显子的剪接情况,可以将VEGF的剪接变异体分为两个活性截然相反的亚家族,其中VEGFxxx亚家族成员使用近端剪接位点,具有促血管生成活性,而VEGFxxxb亚家族成员使用远端剪接位点,具有抗血管生成活性。大量研究证实,VEGF165、VEGF189和VEGF 121等VEGFxxx亚家族成员能够通过促进创面组织血管化加速多种类型创面的愈合过程。然而,VEGFxxxb亚家族成员是否参与创面愈合过程并能影响创面转归仍未知晓。最新研究发现了两个具有抵抗纤溶酶和基质金属蛋白酶降解的VEGF剪接变异体VEGF111和VEGF111b,但目前对VEGF111b血管生成活性的报道却存在争议。研究目标：为了初步揭示VEGF111b的生物学活性及其对创面愈合的影响,本研究使用小鼠皮肤全层缺损模型系统比较了VEGF111和VEGF111b基因治疗的效果。方法和结果：以人乳腺癌MCF7细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增VEGF111和VEGF111bcDNA,分别亚克隆至pIRES2-EGFP获得真核表达载体pIRES2-VEGF111和pIRES2-VEGF111b,并经DNA测序加以证实。使用二氧化硅吸附法大量提取质粒,并使用Triton X-114等温相分离法去除质粒样品中的内毒素。将40只8周龄C57/6J小鼠随机分为空白对照组、PluronicF127对照组、pIRES2-EGFP对照组、pIRES2-VEGF111治疗组和pIRES2-VEGF111b治疗组。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠后,脱毛并消毒术区,使用皮肤活检针在小鼠背部正中线两侧分别做一直径6mm的全层缺损,用内径7mm的环形硅胶膜固定伤口周围皮肤以对抗皮肤收缩,在伤口内滴加包裹有PEI-质粒DNA复合物的Pluronic F127水凝胶,凡士林纱布覆盖,用自粘弹性绷带包扎,分别于3d、5d和7d时照相并取材进行HE和Masson染色分析。结果发现：VEGF111和VEGF111b均能显著促进创面愈合,在7d时两组创面基本上完全愈合,而三个对照组未愈创面面积仍都在初始创面面积的50%以上。尽管在3d时,VEGF111组和VEGF111b组之间的创面愈合存在统计学差异,但在5d时这种差异消失。创面组织微血管计数分析表明与空白对照组和F-127组相比,pIRES2-EGFP组在5d时创面局部微血管数量显著增多(P0.001),提示PEI-质粒的掺入能够促进血管化。同时,VEGF111组和VEGF111b组与pIRES2组相比差异非常显著(P0.001)。然而,VEGF111组和VEGF111b组相比在各时间点微血管数量无统计学差异(P0.05),表明VEGF111和VEGF111b在体内具有相同的促组织血管化能力。对创面组织进行HE染色分析发现,在5d时,空白对照组、F127组和pIRES2组的表皮组织均明显向创面中央爬行,至7d时两翼表皮组织仍未汇合。然而,VEGF111组和VEGF111b组在5d时表皮组织已经完全覆盖创面,表明VEGF111和VEGF111b具有较强的促再上皮化作用。对创面组织进行Masson染色分析发现,在7d时空白对照组、F127组和pIRES2组的创面组织内富含大量蓝染的胶原纤维,而VEGF111组和VEGF111b组则蓝染区域较少,提示VEGF111和VEGF111b均能够抑制胶原纤维沉积。值得一提的是,在5d时VEGF111b组的表皮组织就开始出现内陷并形成毛囊样结构,在7d时毛囊样结构数量明显增多,提示VEGF111b可能具有诱导无疤愈合能力。结论：本研究通过系统比较VEGF111和VEGF111b基因治疗对小鼠皮肤全层缺损模型的治疗作用,证实了在体条件下VEGF111b具有与VEGF111相当的促血管新生作用。同时证实,VEGF111和VEGF111b基因治疗能通过加速再上皮化和增强组织血管化机制显著促进皮肤组织缺损的修复。此外,我们首次发现VEGF111b能够在治疗早期引发表皮层向真皮下陷并形成毛囊样结构,提示过表达VEGF111b能诱导缺损组织的再生性修复。
【图文】：

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【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450;R641

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本文编号：2550660