紫花苜蓿过氧化物酶基因（MsPrx）的克隆及表达与转化研究
发布时间：2019-11-05 04:10
【摘要】：紫花苜蓿是优良的豆科牧草,具有蛋白含量高、适口性强、产量高等优点。我国西北地区是紫花苜蓿主要的种植区域,但是由于紫花苜蓿在西北地区经常受不良环境的影响,极大的影响了其产量与品质。因此获得品质更加优良、抗逆性更强的紫花苜蓿品种对推动我国苜蓿种植业发展具有举足轻重的作用。由于传统的育种手段效率低,对紫花苜蓿产量和品质的改良并没有很大突破。转基因技术具有效率高、目的性强等优点,并且已经在多种植物上取得了瞩目的成就,因此利用分子手段对苜蓿抗逆性进行改良是十分有效的办法。本研究通过同源克隆的方法克隆了紫花苜蓿植物过氧化物酶MsPrx基因,并对该基因及蛋白序列进行了分析,对其分子功能进行了推测;通过实时荧光定量技术对MsPrx基因的不同组织以及NaCl、ABA处理后的基因表达水平进行了测定和分析;通过构建瞬时表达载体对MsPrx基因进行了亚细胞定位;构建了超表达载体并通过组织培养获得了T0代转基因烟草为后续进一步的研究提供了试验材料。主要研究成果如下:1.根据蒺藜苜蓿中植物过氧化物酶基因序列设计引物,利用RACE法获得紫花苜蓿中过氧化物酶基因MsPrx。经过序列分析表明该基因全长1190bp,其中CDS区963bp,编码320个氨基酸。蛋白序列分析表明该蛋白具有信号肽结构,亚细胞定位预测为分泌途径,因此MsPrx蛋白是分泌性过氧化物酶,属于Class III植物过氧化物酶家族。2.通过实时荧光定量PCR分析发现MsPrx基因在苜蓿根、茎、叶中均有表达,但在叶中表达量最高,根中表达量次之,茎中表达量最少。NaCl、ABA处理后MsPrx在根、茎、叶中的表达量均呈现先下降后增加的趋势,表明ABA可能作为信号因子调控MsPrx基因在NaCl胁迫下的表达。3.克隆MsPrx完整的CDS区序列,去掉终止密码子后插入到pCAMBIA1302-mGFP载体中,完成瞬时表达载体MsPrx-GFP的构建。利用烟草叶片进行亚细胞定位。结果表明MsPrx基因定位在高尔基体中,因此在植物抵抗胁迫方面可能具有重要作用。4.构建过表达载体pCAMBIA1302-MsPrx并利用农杆菌介导法转化烟草。经过PCR鉴定转基因成功的烟草,为进一步的试验提供了可靠的试验材料。
【图文】：
定RNA的吸光度发现，所提RNA的OD260/OD280值在1.9左右，含量在1000ng/μL左右，，说明所提取的RNA纯度和质量较高。将已经提取好的RNA进行变性凝胶电泳，可以看到明亮而完整的两条带（图2.1），说明提取RNA完整性较好，可以用于后续的RACE试验。图 2.1 紫花苜蓿总 RNAFig.2.1 Total RNA of alfalfa2.2.2 紫花苜蓿 MsPrx 基因全长克隆通过 NCBI 蒺藜苜蓿 Prx 基因的 EST 序列设计引物。以紫花苜蓿 cDNA 为模板通过PCR 反应并测序获得 720bp 的中间片段。再通过中间片段设计 RACE 引物，经过扩增、凝胶电泳分别获得 750bp 左右的 3’RACE 条带和 500bp 左右的 5’RACE 条带，经切胶回收、测序得到 790bp 的 3’端基因序列和 464bp 的 5’端基因序列，将两端序列通过重叠序列拼接在一起，根据序列设计全长引物进行扩增并通过凝胶电泳获得 1190bp 的基因全长（图 2.2）。经测序获得 ORF 区长 963bp 编码 320 个氨基酸（图 2.3）。14
图 2.2 紫花苜蓿 MsPrx 基因扩增电泳图Fig. 2.2 Amplification of the MsPrx gene of alfalfaM：DNA Marker DL2000；1：3’RACE；2：5’RACE；3：MsPrx 全长2.2.3 紫花苜蓿 MsPrx 蛋白序列分析利用 ProtParam 在线工具（ http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）根据紫花苜蓿 Prx 蛋白序列进行在线分析得到该蛋白等电点 5.45， 相对分子量 34634，氨基酸平均亲水性为-0.024，所以该蛋白为亲水性蛋白（图 2.4）。利用 SOPMA 工具（http://www.expasy.org/）进行二级结构分析发现 MsPrx 氨基酸序列的二级结构包含33.44%的 α-螺旋、24.69%的延伸链、12.50%的 β-转角和 29.38%的不规则卷曲（图 2.5）。利用在线亚细胞定位预测网站（https://www.predictprotein.org）对 MsPrx 蛋白进行亚细胞定位进行预测结果显示该蛋白为分泌（Secreted）。利用 DNAman 软件将 MsPrx 蛋白的氨基酸序列与其他植物过氧化物酶蛋白序列进行比对，发现不同物种间序列都包括3个过氧化物酶保守结构域（FHDCFV，VSCADILA，ALSGAHT）。此外还发现有 8 个与二硫桥形成相关的半胱氨酸（Cys）残基和 2 个与血红蛋白结合的组氨酸（His）残基。此外经蛋白序列比对发现，MsPrx 蛋白序列与蒺藜
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S541.9
本文编号：2555993
【图文】：
定RNA的吸光度发现，所提RNA的OD260/OD280值在1.9左右，含量在1000ng/μL左右，，说明所提取的RNA纯度和质量较高。将已经提取好的RNA进行变性凝胶电泳，可以看到明亮而完整的两条带（图2.1），说明提取RNA完整性较好，可以用于后续的RACE试验。图 2.1 紫花苜蓿总 RNAFig.2.1 Total RNA of alfalfa2.2.2 紫花苜蓿 MsPrx 基因全长克隆通过 NCBI 蒺藜苜蓿 Prx 基因的 EST 序列设计引物。以紫花苜蓿 cDNA 为模板通过PCR 反应并测序获得 720bp 的中间片段。再通过中间片段设计 RACE 引物，经过扩增、凝胶电泳分别获得 750bp 左右的 3’RACE 条带和 500bp 左右的 5’RACE 条带，经切胶回收、测序得到 790bp 的 3’端基因序列和 464bp 的 5’端基因序列，将两端序列通过重叠序列拼接在一起，根据序列设计全长引物进行扩增并通过凝胶电泳获得 1190bp 的基因全长（图 2.2）。经测序获得 ORF 区长 963bp 编码 320 个氨基酸（图 2.3）。14
图 2.2 紫花苜蓿 MsPrx 基因扩增电泳图Fig. 2.2 Amplification of the MsPrx gene of alfalfaM：DNA Marker DL2000；1：3’RACE；2：5’RACE；3：MsPrx 全长2.2.3 紫花苜蓿 MsPrx 蛋白序列分析利用 ProtParam 在线工具（ http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）根据紫花苜蓿 Prx 蛋白序列进行在线分析得到该蛋白等电点 5.45， 相对分子量 34634，氨基酸平均亲水性为-0.024，所以该蛋白为亲水性蛋白（图 2.4）。利用 SOPMA 工具（http://www.expasy.org/）进行二级结构分析发现 MsPrx 氨基酸序列的二级结构包含33.44%的 α-螺旋、24.69%的延伸链、12.50%的 β-转角和 29.38%的不规则卷曲（图 2.5）。利用在线亚细胞定位预测网站（https://www.predictprotein.org）对 MsPrx 蛋白进行亚细胞定位进行预测结果显示该蛋白为分泌（Secreted）。利用 DNAman 软件将 MsPrx 蛋白的氨基酸序列与其他植物过氧化物酶蛋白序列进行比对，发现不同物种间序列都包括3个过氧化物酶保守结构域（FHDCFV，VSCADILA，ALSGAHT）。此外还发现有 8 个与二硫桥形成相关的半胱氨酸（Cys）残基和 2 个与血红蛋白结合的组氨酸（His）残基。此外经蛋白序列比对发现，MsPrx 蛋白序列与蒺藜
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S541.9
本文编号：2555993
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/2555993.html
最近更新
教材专著
