嗜酸氧化亚铁硫杆菌铜、镉抗性相关基因的克隆与过表达分析

发布时间：2019-11-05 20:06

【摘要】：嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,A.ferrooxidans)是生物浸矿应用中最为重要的微生物之一,A.ferrooxidans对多种重金属都具有很高的耐受能力。通过研究其重金属抗性机制,对深入了解微生物细胞维持体内重金属平衡的机理非常重要。目前,A.ferrooxidans铜、镉代谢机理的遗传学研究报道还比较少。A.ferrooxidans中许多与金属抗性相关基因的研究大多集中于生物信息学预测,缺乏相应的实验数据支持,因而我们在A.ferrooxidans全基因组注释信息中挑选了三个与金属抗性相关的基因,分析了其氨基酸序列信息,同时分别构建了这些基因的过表达菌株,为探究这些基因的具体生物学功能提供实验数据支持。研究工作主要有以下几个方面:1、本实验室从甘肃省兰州市七里河区阿干镇煤矿收集酸性矿坑废水分离纯化得到一株A.ferrooxidans L1,革兰氏阴性菌,短杆状;该菌株以Fe~(2+)为能源物质,且具有较高的硫氧化活性,其生长曲线特征显示延滞期较长,约43 h,稳定期约14 h;生长70 h后进入衰亡期;通过驯化试验,该菌株对不同重金属离子显示出不同的耐受能力:在相同培养条件下,Cu~(2+)、Cd~(2+)对A.ferrooxidans L1生长的抑制作用大小为Cu~(2+)Cd~(2+),最高耐受浓度分别是0.04 mol/L和0.08 mol/L。2、运用生物信息学在线分析软件对基因编码的氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能结构域、系统发育以及可能参与的代谢通路等进行了预测。推测AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495这三种蛋白均分布在胞外或细胞膜上,参与金属离子的吸附转运等机制。3、为探究A.ferrooxidans中AFE-1948、AFE-1862、AFE-RS11495的功能特性,以本实验室分离鉴定的A.ferrooxidans L1为材料,采用PCR扩增技术克隆了afe-1948、afe-1862、afe-RS11495基因。将其转化E.coli BL21(DE3),通过SDS-PAGE分析,确定其在大肠杆菌中的最佳表达条件。4、为了进一步地了解这三个基因的功能,采用过表达分析的方法考察了其转入受体菌之后的抗性的变化。结果表明:在不同浓度Cu~(2+)、Cd~(2+)胁迫下,E.coli BL21导入目的基因后,相对于对照组,菌体的生物量明显下降,说明其抗性下降,但是其胞内目的蛋白的含量却有所增加,推测是由于导入目的基因后胞内重金属的含量明显上升导致的。
【图文】：

中的金属离子吸附在细胞壁、胞外聚合物和细胞膜上（如图1.1 所示）。例如，Valls 报道[42]，荧光假单胞菌对 Cd2+吸附主要是细胞壁发挥作用，细胞质和胞外聚合物对 Cd2+的吸附作用较小。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌铜、镉抗性相关基因的克隆与过表达分析3.1 菌株形态特征菌株 L1 可在 pH 2.0 的 9K 液体培养基中生长，培养基由无色变为棕色，呈红棕色，随着时间的延长，培养基中的部分 Fe2+被氧化为 Fe3+并产生了黄矾，培养基变浑浊，产生部分沉淀。革兰氏染色结果表明 L1 菌体染色后呈色，为革兰氏阴性细菌(如图 2.1A)。扫描电镜结果显示该菌株表面光滑，两圆，呈短杆状，长约 1.2-1.5 μm，宽约 0.3-0.4 μm，属于杆状菌(如图 2.1B此推测该菌株为化能自养型的嗜酸杆菌。
【学位授予单位】：兰州理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q93;Q78

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本文编号：2556324