hsp83基因调控果蝇卵巢生殖干细胞命运的研究

发布时间：2019-11-10 00:27

【摘要】：成体干细胞(Adult Stem Cells,ASCs)是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。维持ASCs自我更新和分化之间的平衡对于组织器官的内稳态至关重要。研究表明,来自干细胞的内源因子对这种平衡的维持是必不可少的。此外,ASCs周围微环境(或称“niche”)分泌的因子作为外源信号,也调节着这种平衡。生殖干细胞(Germline Stem Cells,GSCs)是ASCs的一种类型,它在配子发生及种族延续等众多生命过程中扮演着重要的角色。果蝇(Drosophila melanogaster)作为一种经典的模式生物,其卵巢为生殖干细胞调控机制的研究提供了良好的模型。果蝇hsp83为哺乳动物hsp90的同源基因,编码一种热休克蛋白Hsp83。研究表明,Hsp83蛋白主要作为分子伴侣发挥功能,调控众多的生物学过程,如调控果蝇胸、眼、翅膀、刚毛等器官的形态发生,调节果蝇的卵子发生等。在前期的研究过程中,我们发现:与对照组相比,hsp83基因突变体果蝇卵巢生殖干细胞的数量出现了减少的表型。由此,我们设计实验,并借助免疫组化、果蝇转基因及有丝分裂重组等技术,揭示了hsp83基因调控果蝇GSC维持的初步机制。首先,利用免疫组织化学技术特异标记GSCs,研究了三组hsp83突变类型(hsp8308445-/-、hsp8308445/hsp83e6d、hsp8308445/hsp83e6a)羽化后不同天数果蝇卵巢GSC的数量。结果显示:野生型果蝇原卵区通常包含2-3个GSC。羽化后第1天,三组hsp83基因突变类型果蝇正常原卵区(含2-3个GSC)的比例分别为:98.77%、100%、80.43%;羽化后第21天,含有正常原卵区的比例分别下降为:76.90%、73.68%、34.23%。其中,hsp8308445/hsp83e6a一组突变体的表型最为严重,约有44%原卵区未检测到GSC。其次,研究了内、外源性敲低hsp83基因表达(RNA干扰)情况下,羽化后不同天数(1d、7d、14d)果蝇卵巢GSC的数量。结果显示:在三个时间点,对照组中正常原卵区的比例分别为98.36%、94.64%、92.31%,都处于正常水平。当GSC中内源性地敲低hsp83后,正常原卵区的比例分别下降为63.69%、53.56%、12.18%,特别是在第14天出现了严重降低。当GSC微环境中外源性地敲低hsp83后,正常原卵区的比例分别为92.47%、80.49%、69.89%,也出现了轻微的下调。上述结果表明,随着时间的推移,hsp83基因突变及表达下调均导致卵巢GSCs数量呈现为下降趋势。为确证此结果,利用hsp83P-hsp83转基因果蝇品系对突变体进行了表型挽救试验。两组突变类型(hsp8308445/hsp83e6d与hsp8308445/hsp83e6a)的挽救试验结果显示:羽化后第21天正常原卵区的比例分别为90.79%、89.78%,恢复到正常水平。上述结果表明,hsp83基因影响果蝇卵巢生殖干细胞的维持。前期结果表明hsp83内源性下调严重影响了GSC数量维持,为了进一步验证此结果,利用嵌合体分析技术标记hsp83基因突变的GSC,然后统计突变体GSC数量随时间推移的变化情况。结果显示:诱导后第2天,对照组标记的生殖干细胞克隆的比例为51.04%;到诱导后第20天,对照组标记的GSC克隆的比例变为48.54%,仅有4.9%标记的生殖干细胞丢失。而三组标记的hsp83突变(hsp830844、hsp83e6d、hsp83e6a)的GSC克隆的比例在诱导后第2天分别为51.52%、47.37%和46.45%,到诱导后第20天分别下降到32.71%、24.29%和2.90%。与对照组相比,发生了显著地降低。其中,实验组hsp83e6a中有93.8%标记的GSC克隆发生了丢失。此结果表明:hsp83内源性缺失会导致生殖干细胞的丢失。为了进一步揭示hsp83基因是内源性、还是外源性发挥调控作用,进行了一系列的内外源挽救实验。首先,采用内源性挽救品系NosP-hsp83挽救hsp83突变体的表型。羽化后第21天的统计结果显示:突变组hsp8308445/hsp83e6a正常原卵区比例为33.74%,挽救组正常原卵区的比例35.07%,二者无明显差别。表明仅仅内源性补充hsp83未能挽救GSC缺失表型。此外,采用UASP-hsp83转基因品系与NosP-gal4工具株杂交的内源性挽救实验也出现了相似的结果。其次,采用UASP-hsp83转基因品系与c587-gal4工具株进行了外源性挽救实验。结果显示:羽化后第21天,挽救组正常原卵区的比例为21.43%,与hsp83突变组相比,无明显差别。此结果表明仅仅外源性的补充hsp83也不能挽救hsp83突变的表型。总之,综合内、外源挽救实验及之前hsp83P-hsp83转基因挽救实验两方面的结果,充分暗示了hsp83同时发挥着内源和外源性的调控作用,共同调控着GSC的命运。为了揭示hsp83与BMP信号通路的关系,研究了hsp83与该信号交通路的两个组分——Dad和bam的上下位关系。首先,利用免疫荧光染色技术研究了hsp83突变背景下Dad与bam的表达模式。结果显示:实验组中Dad与bam的表达模式与对照组无明显差异。该结果表明hsp83基因不是位于Dad及bam的上游发挥作用。其次,分析比较了bam突变、hsp83突变及hsp83bam双突变条件下GSC的数量变化。结果显示:在这四个时间点(1d、7d、14d与21d),bam突变体卵巢原卵区中均充满生殖干细胞样细胞(tumor);hsp83突变体正常原卵区比例分别为75.00%、59.20%、47.46%、34.23%;双突变体正常原卵区比例分别为75.81%、30.77%、20.45%、14.63%。实验结果显示hsp83bam双突变体果蝇卵巢的表型与hsp83突变体的表型相似。上述结果表明了hsp83基因平行于“BMP-bam”信号通路而发挥功能。最后,采用TUNEL技术检测了hsp83突变GSC的凋亡情况。结果显示,与对照组相比,突变GSC未出现明显的凋亡,暗示了hsp83突变促使GSC提前分化,从而导致GSC丢失。故我们推断:在卵巢中过表达hsp83可能会延迟生殖干细胞和包囊母细胞(CB)的分化。为检验这个推测,进行了hsp83基因过表达实验,统计了果蝇卵巢原卵区中GSC和CB两类细胞(“spectrosome”)的总数量。结果显示:对照组中两类细胞的平均数为3.75。(1)内外源同时过表达的两组果蝇(c587-gal4;UASP-hsp83;NosP-gvp和hsp83P-hsp83)原卵区中两类细胞的平均数分别为4.55和4.29,数量略微增加。(2)内源性过表达的三组(UASP-hsp83;Nos P-gvp、NosP-hsp83和NosP-gal4;UASP-hsp83)的平均数分别为4.01、3.97和3.85,与对照组无明显差异。(3)外源性过表达的两组(UASP-hsp83;Act-gal4、UASP-hsp83;Tub-gal4)的平均数分别为3.92与3.88,与对照组无明显差别。上述结果表明过表达hsp83基因并不能有效的延迟GSC和CB细胞的分化,其具体的分子机制有待进一步研究。总之,研究结果表明:hsp83基因同时发挥着外源性和内源性的调节作用,调控果蝇卵巢生殖干细胞的命运。hsp83基因不依赖“BMP-bam”信号通路发挥功能,可能是通过一种新的机制调控生殖干细胞的命运。
【图文】：

部分性,果蝇,原卵区,干细胞

图 1-1 果蝇部分性状Fig 1-1 characters of Drosophila的基本结构一对卵巢，每个卵巢由 15-20 个卵巢管（ovarioles）是原卵区（germarium），原卵区中有三种干细胞：生cort Stem Cells, ESCs）和体干细胞（Somatic Stem C每个原卵区最顶部是由 8-10 个圆饼状尾丝细胞（Te叠成的尾丝（Terminal Filament, TF），靠近尾丝的pCs），由 E-钙调蛋白介导的细胞粘附固定在原卵区是 2-3 个 GSCs，而和 GSCs 以及帽细胞直接接触的干细胞组成 GSCs 的微环境，这个微环境又被称为“分裂，分裂成两个细胞，一个细胞靠近微环境，维持

信号通路,果蝇,卵巢

4 其他信号通路果蝇发育过程中，Notch 信号通路调控一系列的生物学过程，如翅膀的发育子的发生，嗅觉可塑性的调控等[64; 65]。在果蝇卵巢中，Notch 信号通路还有一重要的作用，就是调控生殖干细胞的维持。主要是通过调控帽细胞的数量，进决定微环境的大小，最终可能是通过BMP 信号通路决定生殖干细胞的命运[66]调控果蝇生殖干细胞维持的还有 E 钙黏蛋白（E-caderion）介导的细胞粘着钙黏蛋白将生殖干细胞紧紧地锚定到帽细胞上，防止生殖干细胞向后转移，使殖干细胞时刻处于微环境中，从而使 GSCs 得以维持[10]。Nos、Pum、Pelo 是 GSC 内源的细胞因子，，它们也能调控果蝇卵巢生殖干细的命运。它们调控生殖干细胞的维持也通过是一条不依赖 bam 的抑制分化的号通路。可能是细胞自主的调控生殖干细胞的命运[61; 67; 68]。
【学位授予单位】：安徽师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q132.1

【参考文献】