人工合成基因重组肽rLj-RGD4对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用

发布时间：2019-11-15 20:04

【摘要】：rLj-RGD4是一个人工合成基因重组肽。本课题组以前期研究的rLj-RGD3为原型进行了缺失突变体的基因设计,并且通过在表达序列增加终止密码子,以获得无纯化标签的rLj-RGD4肽表达。rLj-RGD4的原型rLj-RGD3是一个分子量为14.5 kDa的RGD毒素蛋白,其来源于海洋生物-七鳃鳗。rLj-RGD3含有3个RGD序列,具有强效抗肿瘤功能。由于rLj-RGD3分子量较大,在未来的生物制药中存在潜在的免疫原性风险,故本课题对其进行了蛋白缩短改造,设计出Lj-RGD4基因。本课题人工合成的Lj-RGD4基因构建于pET23b质粒载体,对获得的带有阳性重组质粒(pET23b-RGD4)的表达菌BL21进行了终浓度为1 mM的IPTG重组表达。经对表达时间和表达温度的条件摸索,最后确认rLj-RGD4在30℃条件下诱导12 h可溶性表达量最高。rLj-RGD4为自身带有5个组氨酸残基,故对无纯化标签的rLj-RGD4仍可采用镍柱进行亲和层析纯化。rLj-RGD4肽分子量为6.27 kDa,含有4个RGD模体。纯化蛋白经N-端测序,结果证实表达序列和理论推导序列一致。为了研究无纯化标签的rLj-RGD4肽对肿瘤细胞的生物学功能,本课题采用小鼠黑色素瘤细胞B16作为研究模型进行实验。本课题针对肿瘤的增长和转移的几个关键性步骤,对rLj-RGD4肽的功能进行了测定。细胞增殖实验(MTT法)表明,rLj-RGD4肽能够剂量依赖性地抑制bFGF诱导的小鼠B16细胞的增殖,其作用的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为9.6μM。细胞黏附实验结果表明,rLj-RGD4以剂量依赖方式抑制B16细胞对纤粘连蛋白(fibronectin,FN)的黏附。Transwell法和细胞划痕实验结果证实,rLj-RGD4对碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导的B16细胞迁移具有抑制作用,且呈剂量依赖方式。利用Transwell和人工基质膜Matrigel模仿体内细胞外基质环境进行的细胞浸润实验结果显示,rLj-RGD4对碱性成纤维生长因子诱导的B16细胞浸润具有抑制作用且呈剂量依赖方式:小剂量4.8μM的rLj-RGD4对B16细胞浸润的抑制率为31.7%,中剂量9.6μM的Lj-RGD4对B16细胞迁移的抑制率为72.3%,而高剂量14.4μM的Lj-RGD4对B16细胞迁移的抑制率达到100%。接下来,本课题对rLj-RGD4肽能否引起B16细胞发生凋亡进行了测定。采用Hochest33258染色和TUNEL-FITC染色结果显示,rLj-RGD4能显著呈剂量依赖方式诱导B16细胞发生凋亡,这表明了rLj-RGD4抑制B16细胞增殖的基础是凋亡而不是坏死;利用鬼笔环肽-FITC染色研究了rLj-RGD4对B16细胞骨架的影响。细胞骨架实验结果表明,rLj-RGD4蛋白能以剂量依赖方式破坏细胞骨架并抑制细胞伪足的形成。通过Western blot法进一步研究rLj-RGD4作用于B16黑色素瘤细胞的机制,结果表明其能使Caspase-3酶原表达并裂解成17 kDa亚单位的水平增加、使B16细胞的抗凋亡基因BcL-2表达下调。综上所述,rLj-RGD4能够抑制肿瘤增长与转移的关键性步骤包括增殖、黏附、迁移、浸润及细胞伪足的形成,并且能够诱导B16细胞发生凋亡。由于其rLj-RGD4是分子量只有6.27 kDa的小肽,其更加具有抗肿瘤药物的应用前景。未来随着对rLj-RGD4研究的进一步深入,有望为我国抗肿瘤药物研发提供一类抗肿瘤候选新药。
【图文】：

人工合成基因重组肽 rLj-RGD4 对小鼠黑色素瘤 B16 细胞的抑制作用生密切相关。另外，肩突硬蜱中的 ISL929 和 ISL1373 及来自犬钩细胞上的整合素 CD11b/CD18 的表达而影响白细胞的粘附和及素来源 RGD 肽的结构特征及其所处微环境物毒素来源的去整合素(disintegrins)都是含有 RGD 模体的蛋白合素含有 KGD ( Lys-Gly-Asp)模体。去整合素大多含有丰富的此之外，在动物体内正常标的许多胞外基质蛋白都含有 RGD 模连蛋白（vitronectin , VN），纤连蛋白（fibrinogen, Fg），凝血管性血友病因子（vWF），骨桥蛋白等[35]，并且参与到细胞与[36]。一般具有环形和线形两种结构。由于线形结构的 RGD 很不稳定环形结构的 RGD 肽。环形 RGD 肽与其受体的结合能力和特异

因此，利用αVβ3 的抑制剂则可能显著抑制肿瘤细胞的转移，从率[64]。-2 即人类表皮生长因子受体 2，它在许多癌细胞中都是过表达的。这用 HER-2 通路进行生长和成瘤。因为α5β1 与 HER-2 相互作用，因此可以下调 HER-2 的表达，从而使癌细胞正常化。而且，这种正常化只分即可[66]。的，并不是所有的含有 RGD 的蛋白都能抑制肿瘤细胞的生长。Ba钙粘蛋白 17(cadherin 17 ,CDH17)的第 6 结构域中发现了 1 个 RGD 果 CDH17 过表达，将会促进肿瘤的增殖和黏附；而将其中的 RGD能显著抑制肿瘤生长进程[67]。因此，通过突变该 RGD 序列可能也，有的整合素能促进肿瘤的发展，如αVβ3；而有的则起抑制作用，如于细胞的来源不同，作用机制也不尽相同。另外，，不同作用的 RGD们，对不同的细胞系的致瘤机制应该作深入的研究。这样可能为我们者整合素以及不同的策略来治疗癌症。
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R91

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本文编号：2561455