拟南芥AtPAP1基因植物表达载体构建及在烟草中遗传转化分析
【图文】：
?光光度计在480、649和665nm波长下测量光密度值。根据公式计算叶绿素含量。Chla含量(mg·g-1)=0.005×(12.19×OD665 3.45×OD649)/质量;Chlb含量(mg·g-1)=0.005×(21.99×OD649 5.32×OD665)/质量;Car含量(mg·g-1)=0.005×[1000×OD480 2.14×(12.19×OD665 3.45×OD649) 70.16×(21.99×OD649 5.32×OD665)]×220-1/质量。实验结果1拟南芥AtPAP1基因的克隆及植物表达载体的构建利用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit试剂盒提取拟南芥花序的总RNA(图1-A)。以反转录后的cDNA为模板扩增AtPAP1基因。AtPAP1基因(GenBank登录号AY519563.1)的ORF长度为747bp,共编码248个氨基酸,该基因编码蛋白的分子量为28.5kDa,蛋白质的等电点为9.20。利用限制性内切酶XbaI和SacI对AtPAP1目的片段和pROKII载体进行双酶切反应,用DNAligaseKit进行连接反应,重组载体暂命名为pROKII-图1植物表达载体pROKII-AtPAP1的构建Fig.1TheconstructionofpROKII-AtPAP1vectorA:拟南芥花序总RNA的琼脂糖凝胶电泳图,1、2:拟南芥花序总RNA;B:植物表达载体pROKII-AtPAP1构建的凝胶电泳图,M:DNAmarkerDL5000,1、2:AtPAP1基因的PCR扩增产物,3:pROKII-AtPAP1质粒用XbaI和SacI进行双酶切检测电泳图,4~8:5个pROKII-AtPAP1重组载体的PCR产物。
1202植物生理学报AtPAP1。将连接产物转化入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中,随机挑取单克隆经pROKII载体通用引物PCR验证并提取质粒进行双酶切检测,最终将阳性质粒送公司测序检测。测序结果表明,AtPAP1基因已经重组到pROKII载体上,没有碱基序列突变,pROKII-AtPAP1载体构建成功(图1-B)。2pROKII-AtPAP1载体在烟草中的遗传转化与检测采用叶盘转化法,将农杆菌GV3101(pROKII-AtPAP1)侵染烟草叶片,经过4~5周的选择培养,从叶片周围的愈伤组织分化出红色或淡红色的抗性芽(图2-A)。将抗性芽分离后,放在含有卡那抗生素的分化培养基上继代培养,得到大量从生芽(图2-B),待丛生芽抽茎后,移栽至生根培养基中进行生根培养(图2-C)。提取11个生长30d的转基因烟草抗性苗叶片总RNA,利用实时荧光定量PCR检测AtPAP1基因在不同转基因株系中的相对表达量,结果如图2-D。在11个株系中均有AtPAP1基因表达,基因相对表达量从高到低排序依次为:L4>L1>L9>L6>L5>L8>L11>L3>L10>L7>L2。选取相对表达量不同的的5个株系(L4、L9、L5、L11、L2)移栽至土质培养基中。2周后,观察到转基因株系呈现出由绿色至紫红色的颜色变化,且与AtPAP1基因的表达量成正相关(图2-E)。3转基因植株形态学观察选取表达量低(L2)、中(L5、L8和L11)和高(L1、L4和L9)的转基因植株和野生型植株移栽到土壤,2周左右,用显微镜分别观察叶片形态变化。与野生型相比,转基因植株随着表达量的不同均呈现出不同颜色差异变化,主要表现为叶片下表皮整体变红、主叶脉变红、下表皮上出现点状或侧叶脉变红等,而在野生型中没有发现这些变化。即AtPAP1基因表达量高的株系颜色遍布叶片整体,呈现出深红色(图3-B~D),表达量居中的株系呈现出浅红色(图3-F~H),而AtPAP1基因表达量低的株系只改变叶片局部位置
【参考文献】
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，本文编号：2562374
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