【摘要】：赤潮是当前全球性的海洋环境热点问题。东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)是我国近海海域常见的赤潮藻种,当前对东海原甲藻在各种胁迫环境下的分子适应机制研究不够深入。本文主要对东海原甲藻的两种重要基因—热激蛋白90(Heat Shock Protein 90,HSP90)和视紫红质进行了克隆和表达分析,以期增加对东海原甲藻在各种环境条件下的分子适应机制的认识。HSP90是一种分子伴侣,在帮助蛋白质折叠、维持蛋白结构完整以及保护细胞免受环境胁迫等方面具有重要作用。以前期获得的部分HSP90基因序列为基础,设计了特异性扩增引物,通过c DNA末端快速扩增(Rapid Amplification of c DNA Ends,RACE)技术获得了HSP90的5'端和3'端,将5'端和3'端序列进行拼接,得到了2 443 bp的全长cDNA。将序列提交至Gen Bank数据库,得到的入口号为KX899924。东海原甲藻HSP90基因的全长c DNA序列包括1个111 bp的5′-UTR,1个199 bp的3′-UTR并含有一个poly(A)尾巴,ORF的长度为2 133 bp。ORF编码711个氨基酸,预测氨基酸的等电点为4.95,分子量为85.81 k Da。系统发育树显示,东海原甲藻HSP90属于甲藻属,并与Gen Bank中的Prorocentrum minimun(Accession No.ADP65795.1)和Prorocentrum micans(Accession No.AAR27546.1)的HSP90关系较近。荧光定量PCR结果表明:在温度胁迫下,HSP90的相对表达量在10℃时达到最大,并与20℃相比有显著差异(P0.05),在20℃以下时,HSP90的表达量随着温度升高而逐渐降低,在温度高于20℃时,HSP90的表达量随着温度升高而升高;在氮胁迫下,氮浓度在88μM时HSP90的相对表达量最大,并与对照组(氮浓度为880μM)有显著差异(P0.05);在磷胁迫下,磷浓度在3.6μM时HSP90的相对表达量最大,并与对照组(磷浓度为36.0μM)有显著差异(P0.05),随着氮或磷浓度的降低,HSP90的表达量都呈现先升高后降低的趋势;在铜离子胁迫下,铜离子浓度在31.25μM时HSP90的相对表达量最大,并与对照组(铜离子浓度为0μM)有显著差异(P0.05),HSP90的相对表达量在达到最大值10.81倍后又降低到最小值3.04倍。上述结果说明,温度、营养盐和重金属等胁迫条件可以致使HSP90大量表达以对抗环境胁迫带来的负面影响。视紫红质的主要功能是捕获光能并将其转化为其他能量,该基因在原甲藻中研究甚少,其对不同光谱和光强的转化机制尚未清楚。以前期获得的部分视紫红质基因序列为基础,设计了特异性引物,通过RACE技术获得了视紫红质的5'端和3'端,将5'端和3'端序列进行拼接,得到了1 104 bp的全长c DNA。将该序列提交至Gen Bank数据库,得到的入口号为KY399746。东海原甲藻视紫红质基因c DNA序列包含1个106 bp的5′-UTR,1个221 bp的3′-UTR并含有一个poly(A)尾巴,ORF的长度为777 bp。ORF编码259个氨基酸,预测氨基酸的等电点为5.83,分子量为28.79 k Da。系统进化发育分析发现,东海原甲藻的视紫红质基因与Gen Bank中的Pseudo-nitzschia granii(Accession No.AJA37445.1)的视紫红质基因基因在同一分支,亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示:在持续光照循环中,视紫红质基因的表达量随光照时间延长表现出先升高后降低的趋势;在持续黑暗循环中,视紫红质基因的表达量呈现逐渐降低的趋势,且各组与对照组均有显著差异(P0.05);在暗亮光照循环中,视紫红质基因的表达量在黑暗条件下逐渐降低,恢复光照后表达量又急速上升;在红光、蓝光和绿光照射下,视紫红质基因的表达量在绿色光照组表达量最高,且蓝光、绿光均与白光(对照组)有显著差异(P0.05);在磷胁迫下,视紫红质的表达量随着磷浓度降低而减少,当磷浓度低于7.2μM时,视紫红质的表达量与对照组均有显著差异(P0.05)。进一步通过构建视紫红质基因的重组表达载体,制备视紫红质蛋白重组表达菌株,并用其对该蛋白的光谱特性进行初步分析,发现视紫红质蛋白在320 nm处有最大吸收峰。上述结果为了解东海原甲藻在环境胁迫下的适应机制提供了新见解,对研究其他甲藻的适应机制也有一定的借鉴意义。
【图文】：
28图 2-10 内参基因 GAPDH 引物的扩增曲线和标准曲线Fig. 2-10 The amplification plot and standard curve of GAPDH primers
29图 2-11 HSP90 基因引物的扩增曲线和标准曲线Fig. 2-11 The amplification plot and standard curve of GAPDH prime温度胁迫下 HSP90 基因表达胁迫下 HSP90 基因的相对表达量如图 2-12 所示。其中，20 与对照组相比，，具有显著差异（P < 0.05）的是 10 °C 、15 °C10 °C 时，HSP90 的表达量达到最大，是对照组的 7.6 倍；其次，在这两个温度条件下 HSP90 表达量接近，并为对照组的 5.1 在 25 °C 最低，为对照组的 2.8 倍，并且和对照组没有显著两个极端的温度条件 10 °C 和 30 °C 虽然没有显著差异（P > 胁迫下 HSP90 表达量比较多的两组。温度两两接近的两组比
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 侯静;胡成丽;;浅谈近年我国赤潮的发生概况及防治措施[J];现代交际;2014年06期
2 郭皓;林凤翱;刘永健;许道艳;卢兴旺;;近年来我国海域多发性赤潮生物种类以及赤潮风险指数分级预警方法[J];海洋环境科学;2014年01期
3 洛昊;马明辉;梁斌;朱容娟;梁雅惠;;中国近海赤潮基本特征与减灾对策[J];海洋通报;2013年05期
4 汪芳;葛蔚;柴超;孟祥霞;;氮磷浓度对东海原甲藻优势种群吸附BDE28和BDE47的影响[J];环境科学;2013年08期
5 Chao Chai;Xundong Yin;Wei Ge;Jinye Wang;;Effects of nitrogen and phosphorus concentrations on the bioaccumulation of polybrominated diphenyl ethers by Prorocentrum donghaiense[J];Journal of Environmental Sciences;2013年02期
6 文斐;孙晓霞;郑珊;罗璇;冯秋园;孙松;;2011年春、夏季黄、东海叶绿素a和初级生产力的时空变化特征[J];海洋与湖沼;2012年03期
7 徐烨;刘雅婷;代文琼;朱晓媛;陈雪娇;仵发静;智龙;王曼君;;几种主要的RACE技术及应用[J];中国农业科技导报;2012年02期
8 王宁;兰艳黎;王伟武;;变形菌视紫红质十年的回顾与展望[J];生物物理学报;2010年11期
9 龚良玉;李雁宾;祝陈坚;王修林;曲宝涵;;生物法治理赤潮的研究进展[J];海洋环境科学;2010年01期
10 邓光;耿亚洪;胡鸿钧;齐雨藻;吕颂辉;李中奎;李夜光;;几种环境因子对高生物量赤潮甲藻——东海原甲藻光合作用的影响[J];海洋科学;2009年12期
相关会议论文 前1条
1 林晶;;水体富营养化和赤潮危害及主要防治方法[A];2013中国环境科学学会学术年会论文集（第五卷）[C];2013年
相关博士学位论文 前1条
1 吴萍;新型表面活性剂改性粘土治理赤潮研究[D];中国海洋大学;2005年
相关硕士学位论文 前1条
1 徐孟雪;无机磷胁迫条件下的东海原甲藻差异表达基因的克隆与分析[D];哈尔滨工业大学;2015年
本文编号：
2569636
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/jiyingongcheng/2569636.html
