油棕脂肪酸脱饱和酶基因ω3启动子区的克隆及其表达组织特异性分析

发布时间：2020-01-22 06:53

【摘要】：本研究是以油棕叶片基因组DNA为模板,通过数据库预测的油棕脱饱和酶基因ω3的启动子序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增及TA克隆的方法得到了长度为1 144 bp油棕脱饱和酶基因ω3启动子序列。通过Plant CARE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子不仅含有转录必备的CAAT-box和TATA box,还有大量相关的光反应元件和激素响应元件。通过构建含gus的植物表达载体,农杆菌介导转化转基因拟南芥,对转基因拟南芥进行活性表达分析。结果表明:克隆获得的启动子序列和下游gus基因已经稳定的整合到获得的转基因拟南芥基因组当中;同时,gus基因在拟南芥不同组织中体现出明显的组织特异性,其中,茎干处表达量最高,在叶片的叶脉处表达次之。说明ω3启动子具有活性,可以启动目的基因的转录,本研究为进一步研究启动子的功能及基因表达调控奠定了基础。
【图文】：

图1ω-3启动子克隆注:M:DS5000Marker;1~3:ω-3启动子PCR产物Figure1thecloneofω-3promoterNote:M:DS5000Marker;1~3:PCRamplificationofω-3pro-moter此故有“世界油王”之称(Zeven,1964)。ω-3脂肪酸脱饱和酶是一种脂酰一脂脱饱和酶，存在于植物的内质网膜、质体膜以及蓝藻的类囊体膜上，作用位置存在于ω-3。ω-3脂肪酸脱饱和酶的底物是与载体结合的不饱和脂肪酸，作用是催化与甘油脂结合的二烯脂肪酸形成第三个双键(刘训言等,2004)。ω-3脂肪酸脱饱和酶基因是催化十六碳二烯酸(16:2)或十八碳二烯酸(18:2)(BrowseandSomerville,1991)转化为十六碳三烯酸(16:3或十八碳三烯酸(18:30)(李慧等,2012)的关键酶基因。自从1992年Arondel等(1992)成功克隆了拟南芥内质网ω-3脂肪酸脱饱和酶基因以来，，人们又陆续克隆了豇豆(Yamamotoetal.,1992)、油菜(Yadavetal.,1993)大豆、拟南芥(质体)、蓖麻(Vanetal.,1992)、小白花和小麦等的微体和质体的ω-3脂肪酸脱饱和酶基因。近年来，人们研究ω-3脂肪酸脱饱和酶基因也愈来愈深入，Murakami等(2000)通过基因工程手段使烟草中编码ω-3脂肪酸脱饱和酶的基因保持沉默，从而导致了与野生型植株中的三烯脂肪酸含量相比，突变植株明显减少，而且突变株能更好地适应高温的生长环境。Horiguchi等(2000)研究发现，生长在30℃和10℃条件下的小麦，其根尖中总脂肪酸中C18:3所占比例分别为22%和55%。小麦根尖中α一亚麻酸占总脂肪酸的比例随生长温度的降低而升高的直接原因是小麦TaFad3(小麦内质网ω-3脂肪酸脱饱和酶基因)蛋白量的增长。Zhang等(2005)研究发现，通过将内质网型FAD3基因转入烟草中，可以不同程度的提高转基因植株的抗干旱能力。然而

分子植物育种MolecularPlantBreeding图6转基因拟南芥的PCR鉴定注:M:DS5000Marker;W:野生型拟南芥;1~10:转基因拟南芥Figure6PCRidentificationoftransgenicArabidopsisNote:M:DS5000Marker;W:WildArabidopsis;1~10:Trans-genicArabidopsis图5转基因拟南芥在潮霉素上的筛选注:A:在含有潮霉素的培养基上筛选的植株;B:在无抗培养基上的植株Figure5ScreeningofthetransgenicArabidopsisinHygromycinmediumNote:A:ScreeningoftheplantsinHygromycinmedium;B:inabsenceofmediumresistanceofplants图4ω-3启动子酶切鉴定注:M:DS5000Marker;1~3:ω-3-1300启动子的酶切鉴定产物Figure4Theidentificationofω-3-1300sbyrestrictionenzymesdigestionNote:M:DS5000Marker;1~3:Theidentificationofω-3-1300sbyrestrictionenzymesdigestionamplification取T2代成功进行GUS染色的转基因植株的根、茎、叶、花、果荚、进行提取GUS蛋白进行GUS活性测定及定量分析(图8)，分析结果显示，ω3启动子在转基因拟南芥中的茎的部位活性最高，在叶片处表达活性次之，在根、花、果荚处活性较弱，几乎不表达。2讨论在高等植物中，植物的生长、发育、生理代谢及响应的过程中，基因的表达调控主要是在转录过程中进行的。该过程是受到多种的顺式元件，以及反式因子之间的相互协调共同作用。启动子是一段能与RNA聚合酶及转录因子特异性结合，并决定转录因子的起始的序列(李杰等,2006)，在调控基因转录环节中起着关键作用，它能够决定转录的方向和转录的效率，是转录调控的中心，也是基因工程表达载体的一个重要元件。基因工程中常用的启动子主要有三类：组成型启动子，诱导型启动子(张春晓等,2004)和组织特异?

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