大米过敏原RAG2的基因表达及其抗体的制备与应用

发布时间：2020-01-27 21:10

【摘要】：稻米是亚洲国家和一些西方国家的主食。在谷物类蛋白中,大米蛋白质量最优。然而,在一部分人群中,大米蛋白也可诱发过敏反应。14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂是大米中的主要过敏原。本研究采用基因工程技术获得对应14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的重组蛋白RAG2,并利用重组蛋白制备抗14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的兔多克隆抗体,建立间接竞争Elisa法,用于筛选不同的大米品种,期待获得具有低致敏性的大米品种。研究的主要方法及结论如下:1.利用基因合成技术合成14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的基因RAG2,选用pSUMO-Mutant质粒载体和大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS作为表达系统,将基因连接到pSUMO-Mutant载体上,构建pSUMO-RAG2重组质粒,转化至大肠杆菌ER2925中进行大量克隆扩增,提取质粒进行限制性内切酶酶切分析,显示合成的RAG2基因序列正确。2.pSUMO-RAG2重组质粒在E.coli BL21(DE3)pLysS中成功诱导表达,追踪SUMO-RAG2融合蛋白,发现它是细胞内的不溶性的包涵体表达;对包涵体进行变性与复性,并通过Ni柱进行亲和层析获得SUMO-RAG2融合蛋白。3.免疫家兔,制备出抗大米过敏原14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的多克隆抗体,其效价高达1:320,000。4.收集江西28个水稻品种,提取盐溶性蛋白,采用SDS-PAGE电泳和基于抗RAG2多克隆抗体的免疫印迹法检测28个品种的过敏原RAG2含量,结果初步显示,这28个品种中不与抗RAG2的抗血清反应,最后选用间接竞争Elisa方法测出每个品种的IC50,从而筛选出抗原性低的大米品种。
【图文】：

第 1 章 前言白的氨基酸序列，尤其是其中半胱氨酸残基的数目和位置，与小麦的 α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂非常相似。α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂面包师哮喘的主要过敏原，属于植物性食物过敏原中的醇溶谷蛋白4～16 kD 过敏蛋白包括 RAG1、RAG2 和 RA5 基因片段，其中 RAation activating gene 1）被认为是大米中主要过敏原，，它编码大米 16 艳芳等[11]通过 DNAStar Protean 生物信息学软件采用多方案和多参1 的氨基酸序列，预测其二级结构和 B 细胞表位，得出了第 33～44155～163 区段可能是 B 细胞的优势表位。

图 2.1 pSUMO-RAG2 图谱Fig2.1 the map of pSUMO-RAG22 pSUMO-RAG2 的酶切鉴定从 ER2925 中提取重组质粒 pSUMO-RAG2，对重组质粒进行单酶切，采用琼脂糖凝胶电泳检测，从图 2.2 可以看到在 7,000bp 下方有明亮的基数与重组质粒 pSUMO-RAG2 的碱基数 6038bp 相符；双酶切泳道 400 下方有明亮的条带，其碱基数与基因 RAG2 的碱基数 436bp 相符。定电泳图如下：
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS210.7

【参考文献】

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本文编号：2573765