油菜细胞核雄性不育系9012A不育基因BnRf~b的克隆与功能分析

发布时间：2020-02-01 17:01

【摘要】：油菜是全世界主要农作物之一,是食用植物油和饲用蛋白质的重要来源,其工业用途也十分广泛。杂种优势利用对油菜产量的提高起到了重要推动作用,在杂种优势利用途径中雄性不育的利用是主要途径之一,细胞核雄性不育系9012A及其衍生系已经被广泛应用于油菜杂交种商业化制种,其雄性不育性状由Bn Ms3和Bn Rf两个位点控制。为解析9012A雄性不育及其育性恢复的分子机理,恢复基因Bn Ms3已经被成功克隆,其编码的蛋白与叶绿体内膜转运蛋白Tic40同源;前人对Bn Rf位点已经精细定位,并通过BAC测序得到了临保系中等位基因Bn Rf c的候选区间。本研究在前人研究的基础上,进一步发现不育系和恢复系中Bn Rf候选区间序列与临保系参考序列差异很大。为获得不育系和恢复系中Bn Rf候选区间真实序列,构建了包含Bn Rf位点不育基因BnRf~b和恢复基因Bn Rf a的BAC克隆文库,通过测序分别得到了包含BnRf~b和Bn Rf a的候选区间序列,揭示了不育系和恢复系材料在Bn Rf位点复杂的染色体结构变异。同时,通过分析RG206AB和RG250AB两个不同遗传背景的定位群体,本研究对Bn Rf位点育性控制基因进行了进一步精细定位,并完成了不育基因的克隆与功能验证。主要研究结果如下:1、本研究构建了一个甘蓝型油菜基因组BAC文库,筛选得到了分别包含Bn Rf a和BnRf~b的BAC单克隆。序列分析发现,相对于临保系,不育系和恢复系在Bn Rf位点存在一个大片段插入以及一个局部序列的倒位,Bn Rf基因在恢复系的定位区间实际为58.1 Kb,在不育系中相对应的区间为63.1 Kb。2、根据不育系和恢复系中Bn Rf候选区间的序列差异,新开发了8个分子标记,通过分析RG206AB和RG250AB两个定位群体,最终将Bn Rf a限定到35.9 Kb的物理区间内,预测包含7个开放阅读框(ORF)。3、候选基因G14在不育系和恢复系中的等位基因,在启动子区域存在两个插入缺失变异,最有可能是目标基因。本研究通过农杆菌介导将包含不育系来源G14全长的基因组片段AGS14-1转化到遗传背景为Bnms3的野生型拟南芥中,获得了27株转基因阳性单株。表型调查发现27个阳性单株都表现为花丝短小,花药皱缩,没有可育花粉,其雄性不育表型与RG206A十分相似;T1代阳性单株与野生型杂交,在T2代分离群体中,雄性不育表型与AGS14-1转基因片段共分离。进一步的细胞学观察表明,不育拟南芥与RG206A花药的异常发育过程也基本相同。不仅如此,外源导入Bn Ms3还能够彻底恢复AGS14-1导致的拟南芥雄性不育,这与甘蓝型油菜中Bn Ms3能够特异性恢复9012A类型不育系的育性相一致。因此,可以确认基因组片段AGS14-1包含导致RG206A产生雄性不育的BnRf~b基因。4、将恢复系中与AGS14-1等位的基因组片段AGS14-2导入拟南芥野生型,转基因阳性单株也均表现为雄性不育,因此恢复系来源的基因组片段AGS14-2可能也包含雄性不育基因BnRf~b。因而推测,Bn Rf位点恢复基因Bn Rf a与不育基因BnRf~b可能并不等位,恢复基因可能对应于35.9 Kb候选区段内的另一个基因。5、AGS14-1和AGS14-2片段上都包含预测的开放阅读框G14,其蛋白编码序列完全相同。通过PCR从RG206H花药c DNA文库中扩增获得的G14全长CDS包含9个外显子,编码一个1386个氨基酸的蛋白。DNA水平和蛋白水平的同源性分析表明G14是一个嵌合基因,由3段与不同基因同源的序列组成。由于G14中较大一段序列与mt HSP70-1高度同源,因此我们将G14命名为Bna A7.mt HSP70-1-like。在可育材料RG206H中,Bna A7.mt HSP70-1-like在花药发育的整个过程中持续表达,在减数分裂时期其表达水平较高;而在不育材料RG206A中,Bna A7.mt HSP70-1-like仅在花药发育的减数分裂时期有微弱表达。6、油菜核不育基因Bna A7.mt HSP70-1-like在拟南芥中异位表达,对绒毡层分化相关基因没有明显影响,但却明显抑制了绒毡层退化相关基因的表达。与此相一致,在油菜不育系RG206A中我们观察到绒毡层细胞的PCD明显延迟。7、在公用数据库中的序列比对分析,仅在甘蓝参考基因组上找到一个Bna A7.mt HSP70-1-like基因的同源基因,拟南芥及其他物种中均没有该嵌合基因的同源基因。甘蓝型油菜和白菜参考基因组上也不存在Bna A7.mt HSP70-1-like或其同源基因,但本研究对190份甘蓝型油菜及24份白菜材料进行分析,其中有52份甘蓝型油菜及20份白菜材料包含Bna A7.mt HSP70-1-like基因。
【图文】：

序列,制种模式,细胞核雄性不育,三系

图 1.19012A 类型细胞核雄性不育系三系化制种模式（Dong et al., 2012）Fig.1.1 Schematic diagram of three-line breeding process for the recessive nuclear male sterility（Dong et al., 2012）1.1.2 9012A 不育系雄性不育相关基因的定位柯丽萍等以9012AB为研究材料，应用BSA法构建了可育基因池和不育基因池，筛选得到了 7 个与 Bnms3 基因紧密连锁的分子标记，通过对 1506 个单株的近等基因系群体分析，将目标基因定位在 0.5 cM 的遗传距离内，，实现了对 Bnms3 基因的精细定位（柯丽萍，2005；Ke et al., 2005）。何俊平等通过紧密连锁分子标记的序列比对分析，在拟南芥第五染色体上找到了 Bnms3 定位区间的同源区段，结合油菜、甘蓝和白菜的ESTs、GSSs序列，开发出了6个与 Bnms3 基因紧密连锁的ACGM 标记，最终将目标基因的定位区间进一步缩小到了 0.034cM 的遗传距离内（He et al., 2008Huang 等则以近等基因系群体 7-7365AB 为材料，将 Bnms3 基因定位在甘蓝型油菜N19 连锁群（Huang et al., 2007）。Dun 等根据甘蓝型油菜定位区间与拟南芥序列的

叶绿体蛋白,修正模型

图 1.2 叶绿体蛋白转运的修正模型Fig.1.2 Model for the protein import in chloroplast（Nakai, 2015）1.2.3 Tic40 可能与质体内脂类合成相关高等植物中饱和脂肪酸的合成在叶绿体基质中进行，叶绿体内膜在脂类合成中也发挥着重要作用。绒毡层中特化的质体结构——造油体，富含由单半乳糖甘油二脂、甘油三酯、甾醇酯等脂类组成的油滴，在小孢子发育后期绒毡层细胞裂解后，为花粉外壁合成提供必不可少的脂类物质。在修正的叶绿体内膜蛋白转运模型中，Tic40 并未参与内膜蛋白转运子的组成，因此 Tic40 的真实功能值得重新考虑。也许 Tic40 确实是作为叶绿体基质中分子伴侣蛋白结合在内膜上的支架，在蛋白跨膜过程的晚期参与到叶绿体内膜蛋白转运（Land Chiu, 2010）。但也有可能，Tic40 并不直接参与叶绿体内膜蛋白转运过程，而是在质体形成的其它环节发挥重要功能从而间接影响叶绿体的蛋白转运能力。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.4

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