条形柄锈菌小麦专化型葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因PsG6PDH1的表达特征及功能分析
发布时间：2020-02-05 10:19
【摘要】：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径中的关键限速酶。基于已测序的条形柄锈菌小麦专化型基因组序列,利用RT-PCR方法克隆了该病菌葡萄糖-6-磷酸脱氢酶PsG6PDH1的全长cDNA序列(1 497bp),编码498个氨基酸的蛋白。编码蛋白含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的保守功能域。系统进化分析发现,PsG6PDH1与禾柄锈菌小麦专化型的G6PDH聚为一簇。qRT-PCR分析表明,PsG6PDH1在病菌侵染早期的表达明显上调,其中侵染24h时表达量最高,为对照夏孢子的30倍。将PsG6PDH1导入酿酒酵母G6PDH缺失突变体中成功表达,并表现出较强的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性,明显酵母增强了菌株对过氧化氢的耐受性。由此推测,PsG6PDH1可能参与了条形柄锈菌小麦专化型在侵染寄主时抵御寄主的氧化胁迫反应。研究结果为进一步研究该病菌基础代谢及侵染机理奠定一定的理论基础。
【图文】：
王秋玲等/条形柄锈菌小麦专化型葡萄糖 6 磷酸脱氢酶基因PsG6PDH1的表达特征及功能分析菌物学报1203果进行分析获得PsG6PDH1基因序列，，经ORFFinder预测，该基因含有1497bp的ORF。提取病菌CYR32萌发的夏孢子的RNA，合成cDNA第一链为模板，利用引物G6PDH F/G6PDH R进行RT PCR扩增，回收目标片段，并克垄测序（图1），测序结果与基因组公布序列一致。图1条形柄锈菌小麦专化型PsG6PDH1cDNA的扩增及克隆验证A：RT PCR扩增PsG6PDH1cDNA；B：重组质粒pMD18 Tsimple PsG6PDH1的双酶切（XhoⅠ/KpnⅠ）鉴定.Fig.1AmplificationandcloningofPsG6PDH1cDNAfromPucciniastriiformis.A:AmplificationofthePsG6PDH1cDNAusingRT PCR;B:IdentificationoftherecombinantplasmidpMD18 Tsimple PsG6PDH1byrestrictiondigestionwithXhoⅠ/KpnⅠ.ProtParam软件预测PsG6PDH1基因编码498个氨基酸，分子量大小为56.59kDa，等电点为8.54。利用Pfam对目的蛋白的结构域进行预测，结果显示该蛋白中含有葡萄糖六磷酸脱氢酶保守功能域（图2A），一个NAD（P）结合域（第15 205位氨基酸），一个葡萄糖六磷酸脱氢酶激活位点（192 198位氨基酸）。为进一步明确PsG6PDH1与其他真菌G6PDH蛋白的进化关系，从BLASTP搜索的PsG6PDH1同源蛋白并选择了12个来自担子菌门和子囊菌门真菌的G6PDH蛋白序列，利用ClustalW1.83进行同源性比对。结果显示，PsG6PDH1与禾柄锈菌小麦专化型P.graminisf.sp.triticiCRL75 36 700 3的G6PDH同源性最高，相似性达到95%；与青杨叶锈菌Melampsoralarici populina98AG31的G6PDH相似性达到86%，但与酿酒酵母S.cerevisiaeS288c的G6PDH的相似性仅为54%。通过MEGA5.1软件构建系统进化树（图2B），结果表明，PsG
隆验证A：RT PCR扩增PsG6PDH1cDNA；B：重组质粒pMD18 Tsimple PsG6PDH1的双酶切（XhoⅠ/KpnⅠ）鉴定.Fig.1AmplificationandcloningofPsG6PDH1cDNAfromPucciniastriiformis.A:AmplificationofthePsG6PDH1cDNAusingRT PCR;B:IdentificationoftherecombinantplasmidpMD18 Tsimple PsG6PDH1byrestrictiondigestionwithXhoⅠ/KpnⅠ.ProtParam软件预测PsG6PDH1基因编码498个氨基酸，分子量大小为56.59kDa，等电点为8.54。利用Pfam对目的蛋白的结构域进行预测，结果显示该蛋白中含有葡萄糖六磷酸脱氢酶保守功能域（图2A），一个NAD（P）结合域（第15 205位氨基酸），一个葡萄糖六磷酸脱氢酶激活位点（192 198位氨基酸）。为进一步明确PsG6PDH1与其他真菌G6PDH蛋白的进化关系，从BLASTP搜索的PsG6PDH1同源蛋白并选择了12个来自担子菌门和子囊菌门真菌的G6PDH蛋白序列，利用ClustalW1.83进行同源性比对。结果显示，PsG6PDH1与禾柄锈菌小麦专化型P.graminisf.sp.triticiCRL75 36 700 3的G6PDH同源性最高，相似性达到95%；与青杨叶锈菌Melampsoralarici populina98AG31的G6PDH相似性达到86%，但与酿酒酵母S.cerevisiaeS288c的G6PDH的相似性仅为54%。通过MEGA5.1软件构建系统进化树（图2B），结果表明，PsG6PDH1与担子菌门的禾柄锈菌小麦专化型P.graminisf.sp.tritici、青杨叶锈菌Melampsoralarici populina、玉米瘤黑粉Ustilagomaydis、裂褶菌Schizophyllumcommune的G6PDH蛋白聚为一类；而子囊菌门真菌的G6PDH聚为一类，表明PsG6PDH1与来自担子菌门的真菌的G6PDH图2条形柄锈菌小麦专化型PsG6PDH1结构域预测及系统进化分析A：条形柄锈菌小麦专化型PsG6PDH1蛋白的结构域预测；B：条形柄锈菌小麦专化型PsG6PDH1与其他真
本文编号：2576618
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王秋玲等/条形柄锈菌小麦专化型葡萄糖 6 磷酸脱氢酶基因PsG6PDH1的表达特征及功能分析菌物学报1203果进行分析获得PsG6PDH1基因序列，，经ORFFinder预测，该基因含有1497bp的ORF。提取病菌CYR32萌发的夏孢子的RNA，合成cDNA第一链为模板，利用引物G6PDH F/G6PDH R进行RT PCR扩增，回收目标片段，并克垄测序（图1），测序结果与基因组公布序列一致。图1条形柄锈菌小麦专化型PsG6PDH1cDNA的扩增及克隆验证A：RT PCR扩增PsG6PDH1cDNA；B：重组质粒pMD18 Tsimple PsG6PDH1的双酶切（XhoⅠ/KpnⅠ）鉴定.Fig.1AmplificationandcloningofPsG6PDH1cDNAfromPucciniastriiformis.A:AmplificationofthePsG6PDH1cDNAusingRT PCR;B:IdentificationoftherecombinantplasmidpMD18 Tsimple PsG6PDH1byrestrictiondigestionwithXhoⅠ/KpnⅠ.ProtParam软件预测PsG6PDH1基因编码498个氨基酸，分子量大小为56.59kDa，等电点为8.54。利用Pfam对目的蛋白的结构域进行预测，结果显示该蛋白中含有葡萄糖六磷酸脱氢酶保守功能域（图2A），一个NAD（P）结合域（第15 205位氨基酸），一个葡萄糖六磷酸脱氢酶激活位点（192 198位氨基酸）。为进一步明确PsG6PDH1与其他真菌G6PDH蛋白的进化关系，从BLASTP搜索的PsG6PDH1同源蛋白并选择了12个来自担子菌门和子囊菌门真菌的G6PDH蛋白序列，利用ClustalW1.83进行同源性比对。结果显示，PsG6PDH1与禾柄锈菌小麦专化型P.graminisf.sp.triticiCRL75 36 700 3的G6PDH同源性最高，相似性达到95%；与青杨叶锈菌Melampsoralarici populina98AG31的G6PDH相似性达到86%，但与酿酒酵母S.cerevisiaeS288c的G6PDH的相似性仅为54%。通过MEGA5.1软件构建系统进化树（图2B），结果表明，PsG
隆验证A：RT PCR扩增PsG6PDH1cDNA；B：重组质粒pMD18 Tsimple PsG6PDH1的双酶切（XhoⅠ/KpnⅠ）鉴定.Fig.1AmplificationandcloningofPsG6PDH1cDNAfromPucciniastriiformis.A:AmplificationofthePsG6PDH1cDNAusingRT PCR;B:IdentificationoftherecombinantplasmidpMD18 Tsimple PsG6PDH1byrestrictiondigestionwithXhoⅠ/KpnⅠ.ProtParam软件预测PsG6PDH1基因编码498个氨基酸，分子量大小为56.59kDa，等电点为8.54。利用Pfam对目的蛋白的结构域进行预测，结果显示该蛋白中含有葡萄糖六磷酸脱氢酶保守功能域（图2A），一个NAD（P）结合域（第15 205位氨基酸），一个葡萄糖六磷酸脱氢酶激活位点（192 198位氨基酸）。为进一步明确PsG6PDH1与其他真菌G6PDH蛋白的进化关系，从BLASTP搜索的PsG6PDH1同源蛋白并选择了12个来自担子菌门和子囊菌门真菌的G6PDH蛋白序列，利用ClustalW1.83进行同源性比对。结果显示，PsG6PDH1与禾柄锈菌小麦专化型P.graminisf.sp.triticiCRL75 36 700 3的G6PDH同源性最高，相似性达到95%；与青杨叶锈菌Melampsoralarici populina98AG31的G6PDH相似性达到86%，但与酿酒酵母S.cerevisiaeS288c的G6PDH的相似性仅为54%。通过MEGA5.1软件构建系统进化树（图2B），结果表明，PsG6PDH1与担子菌门的禾柄锈菌小麦专化型P.graminisf.sp.tritici、青杨叶锈菌Melampsoralarici populina、玉米瘤黑粉Ustilagomaydis、裂褶菌Schizophyllumcommune的G6PDH蛋白聚为一类；而子囊菌门真菌的G6PDH聚为一类，表明PsG6PDH1与来自担子菌门的真菌的G6PDH图2条形柄锈菌小麦专化型PsG6PDH1结构域预测及系统进化分析A：条形柄锈菌小麦专化型PsG6PDH1蛋白的结构域预测；B：条形柄锈菌小麦专化型PsG6PDH1与其他真
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