镉胁迫及MTF1对斑马鱼id1基因的调节机制

发布时间：2020-02-12 11:25

【摘要】：为了研究镉胁迫及金属调节转录因子MTF1(metal transcription factor 1)对斑马鱼(Danio rerio)id1基因的影响和调节机制,本硕士学位论文分别利用实时荧光定量PCR、重组质粒的体外细胞转染及双荧光素酶报告系统实验,探索了可能发生的部分调节机制;同时,通过斑马鱼胚胎注射和双荧光素酶报告系统的方法,对id1启动子活性的整体情况及体内外活性的变化进行了研究。具体内容如下:1.镉胁迫斑马鱼后id1基因及mtf基因表达量变化分别使用0、1/25和1/5LC50镉对斑马鱼进行胁迫,4天后对存活斑马鱼对照组及镉处理组的肝脏、鳃、肠道、脾脏及肾脏分别取材,提取RNA并进行反转录,通过实时荧光定量PCR的方法对各组织中id1、mtf1及mtf2的表达量变化分别进行了检测。结果显示,镉胁迫斑马鱼96 h后,在肝脏组织中,三个基因表达量均出现了显著性上调:id1在高浓度组显著性上调(P0.05),mtf1和mtf2在低浓度组中分别极显著(P0.01)和显著上调(P0.05);在鳃组织中,id1表达量在高浓度组极显著升高(P0.01),在低浓度组有上升趋势,但没有显著性变化。mtf1在低浓度组显著性下调(P0.05),高浓度组又呈现上调,与对照组基本持平。mtf2与mtf1变化趋势相同,但与对照组相比没有显著性差异;在肠、脾脏、肾脏组织中,三个基因表达量在镉胁迫后均呈现出低浓度组逐渐上升,高浓度组先升后降的趋势,但均没有显著性变化。2.双荧光素酶报告实验体外研究MTF1对id1基因的调节机制因MTF1在其他物种中研究较多,且已被广泛认定为是应答金属胁迫的主要因子。而MTF2研究较少且功能不确定。因此,本论文只研究了MTF1对id1的作用。通过生物信息学方法对id1基因启动子序列进行了分析。发现,在id1启动子上5’端翻译起始位点之前约3kb片段中,存在7个MRE(金属应答调节元件)位点,并将其以距离ATG位置最近起始,分别命名为MRE1-7;之后,使用半巢式PCR及引物突变PCR的方法构建了一系列质粒,包括斑马鱼id1启动子报告质粒(ID1-2.8k-PGL3)以及各MRE位点单点突变质粒(mMRE1-7PGL-3)、MTF1转录因子真核表达质粒(MTF1-pcDNA3.1)及其突变体质粒dnMTF1-pc DNA3.1。通过质粒体外转染鲤鱼上皮瘤(epithelioma papulosum cyprinid,EPC)细胞,使用双荧光素酶报告系统检测MTF1转录因子(野生型及突变型)对斑马鱼id1启动子(野生型及突变型)活性变化的影响。结果发现,MTF1对id1启动子的活性影响存在浓度依赖性,表现出低促高抑的趋势,id1启动子上7个MRE位点对id1启动子活性的作用存在差异,MRE3、MRE7对id1启动子活性具有负调节作用,MRE1、MRE5对id1启动子活性具有正调节作用。3.斑马鱼id1启动子体内外活性分析通过构建斑马鱼id1启动子不同长度荧光素酶报告质粒,分别以EPC细胞和斑马鱼胚胎为材料进行了体外转染和体内注射,并采用双荧光素酶报告系统对不同长度斑马鱼id1启动子在体内、外的活性情况进行了分析。结果显示,不同长度id1启动子活性,在体内、体外实验中均表现出随着启动子长度变化而变化的情况。同时,启动子活性变化趋势在体内和体外并不一致,呈现较大差异性。从研究结果得出如下结论:1.镉对斑马鱼的胁迫可以促进肝脏和鳃中id1基因及MTF1转录因子的表达变化,表明id1基因和mtf基因在镉胁迫机体的应答过程中发挥重要的调节作用。在各组织中不同的变化表明,镉胁迫后各组织的应激反应有所差异,且id1基因及mtf基因的表达具有组织差异性。在肝脏中,id1基因及mtf基因同时上调表明,id1基因的上调或许和mtf基因的高表达相关。2.双荧光素酶报告系统实验表明,id1基因可能部分受到MTF1因子的调节,并且MTF1对id1基因的影响呈现低促高抑的趋势。对id1启动子上金属应答元件(metal responsive elements,MRE)的突变实验表明,各MRE元件对id1启动子活性的贡献不同。3.斑马鱼id1启动子体内外活性分析结果表明,id1启动子活性随长度变化不同表现各异,说明启动子上存在众多顺式调控元件。体内外活性趋势的差异表明,不同细胞中的调控机制有所不同,且在体内、外id1活性变化受影响的因素有所差异。与体外相比体内更为复杂。体内、外id1活性变化不同的结果,进一步印证了镉胁迫后实时荧光定量PCR对id1基因的检测结果,即在各组织中id1表达趋势存在差异。
【图文】：

图 3.1 斑马鱼 MTF1 因子结构示意图Figure3.1 sketch map of the zebrafish MTF1 structure图 3.2 斑马鱼 MTF1 突变示意图Figure3.2 sketch map of the zebrafish MTF1 mutation3.2 结 果

图 3.2 斑马鱼 MTF1 突变示意图Figure3.2 sketch map of the zebrafish MTF1 mutation2 结 果通过使用半巢式 PCR，本实验成功构建了 id1 启动子报告质粒 ID1-PGL3.0。用 id1 质粒模板，使用 Q5 超保真酶，通过定点突变 PCR 方法成功构建了 7 个 M点突变质粒：mMRE1、mMRE2、mMRE3、mMRE4、mMRE5、mMRE6、mMRE序结果表明，突变成功率为 80%（4/5）；通过普通 PCR 成功构建了 MTF 转录真核表达质粒 MTF1-pcDNA3.1-c-myc。同时，构建了 MTF1 转录活性区缺失质TF1-△TAD-pcDNA3.1-c-myc，在此质粒基础上，，通过搭桥 PCR 构建了 MTF1 突质粒 dnMTF1- pcDNA3.1-c-myc。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X503.225

【参考文献】

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1 陈伟;陈

本文编号：2578804