FKS家族基因对酵母细胞形态及抗自溶性能的作用

发布时间：2020-02-14 22:05

【摘要】：酵母在酿酒、制药、食品等行业的工业生产中有非常重要的应用价值,同时,酵母也是真核生物研究的重要模式生物。在生产实践中,酵母细胞的自溶衰亡会对产品的品质造成不利影响,例如给啤酒带来浓重的不良风味等。酵母细胞壁是维持细胞自身形态构造、抵抗外界机械压力和维持渗透压的重要组成部分。β-1,3-葡聚糖是组成细胞壁的重要结构,FKS家族基因是合成β-1,3-葡聚糖合成酶的关键基因。为探究细胞壁β-1,3-葡聚糖对维持细胞的生理特性作用,了解酵母自溶的机理和调控因子,本文通过分子改造对FKS家族基因进行敲除,分析比较原始菌株和重组菌株的细胞壁形态、细胞壁组成成分、酵母抗自溶能力、抗环境胁迫能力和细胞壁合成相关基因表达状况等,以此研究FKS家族基因与酵母细胞形态以及酵母抗自溶性能的关系。主要研究结果如下:(1)构建重组菌株:以FKS1基因缺陷菌株和FKS2基因缺陷菌株为出发菌,分别以尿嘧啶和组氨酸营养缺陷型为筛选标记分别敲除FKS2和FKS3基因,最终得到FKS1、FKS2双基因缺陷菌株,FKS1、FKS3双基因缺陷菌株,FKS2、FKS3双基因缺陷菌株和FKS1、FKS2、FKS3三基因缺陷菌株,对重组菌株分别命名为fks1,2-QT、fks1,3-QT、fks2,3-Q和fks1,2,3-QT。(2)对重组菌株细胞形态的分析:FKS1、FKS2和FKS3基因单独敲除对酵母细胞形态没有太大影响,而在FKS1和FKS2敲除的重组菌株,酵母形态变成椭圆形。同时,fks1,2-QT和fks1,2,3-QT的体积相对于原始菌株W303分别减小了71.26%和74.25%。因此,基因FKS1和FKS2共同作用控制酵母的细胞形态。(3)FKS家族基因对酵母细胞壁多糖的影响:FKS家族基因与酵母合成细胞壁β-1,3-葡聚糖合成相关,fks1-QT的细胞壁厚度相对原始菌W303变薄了49%,β-1,3-葡聚糖的含量相对原始菌株降低60%,证明了FKS1基因对β-1,3-葡聚糖合成酵母细胞壁起重要的作用。fks2-QT和fks3-QT的细胞壁β-1,3-葡聚糖的含量变化不大,FKS2和FKS3基因对酵母细胞壁葡聚糖的合成影响并不是很大,并且FKS家族基因之间的叠加效果并不明显。但是,如果在同时敲除FKS1和FKS2基因的重组菌种,细胞壁β-1,3-葡聚糖含量相对于原始菌株反而增加了,酵母细胞存在合成β-1,3-葡聚糖的其他补偿途径。(4)FKS家族基因与酵母细胞抗自溶能力的关系:在模拟自溶液中,fks1-QT和fks1,2,3-QT抗自溶能力最差,这两株突变菌株的自溶严重程度和死亡率明显高于其它菌株,FKS1在对酵母抵抗自溶的过程中起了重要的作用。fks3-QT的抗自溶能力优于原始菌株,WSC2和MSN4基因主要作用是感受环境压力,fks3-QT的WSC2和MSN4的基因的表达量分别上调了6.88和5.25,这两个基因的大幅上调导致酵母细胞对于外界环境的变化敏感,在短时间内对细胞做出调整。
【图文】：

技术路线图,技术路线,思路,自溶

第一章绪论传特征[50]，使研究单个或多个基因的功能较为困难，因此选用单倍体模式菌株进行研究。本课题的主要研究内容为：利用模式酵母营养缺陷型菌株，在前期研究中构建的 FKS1基因敲除菌株和 FKS2 基因敲除菌株，敲除 FKS2 或 FKS3 得到双基因敲除和三基因敲菌株；测定基因工程菌的细胞壁厚度、细胞体积、细胞壁多糖含量的变化；将基因工程菌和原始菌株置于模拟自溶环境中，对比酵母死亡率及抗自溶能力；对比关键基因的表达量，明确 FKS 家族基因对酵母细胞形态、酵母抗自溶能力的作用。下图 1-1 为本研究主要的技术路线和研究内容：

琼脂,培养酵母,胰蛋白胨,酵母提取物

台式高速离心机北京医用离心机厂微镜日本 OLYMPUS 公司0 分光光度计上海天美科学仪器有限公司基及试剂养基：氯化钠 10 g·L-1，酵母提取物 5 g·L-1，胰蛋白胨 10 g·L-1。在筛入的 150 μg·mL-1氨苄青霉素，固体培养基中添加 18-20 g·L-1的琼脂于培养大肠杆菌。养基：葡萄糖 20 g·L-1，酵母提取物 10 g·L-1，胰蛋白胨 20 g·L-1。制20 g·L-1的琼脂，YPD 培养基主要用于培养酵母。部分菌株培养时需添遗传霉素(G418)，，YPD 培养基主要用于培养酵母。养基(Synthetic Dropout Medium)：无氨基酵母氮源 6.7 g·L-1，葡萄糖 2物 2 g·L-1(成分如附表 1 所示)。制备平板时添加 18-20 g·L-1的琼脂，菌株。迫抗性平板：分别在 YPD 平板中添加 0.4 mol·L-1的 NaCl、8%的无水的米卡芬净。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q932

【参考文献】