半定量RT-PCR方法检测FADX基因在油桐种子发育过程中的表达
【图文】：
图1油桐总RNA提取电泳图Figure1ElectrophoresisoftotalRNAofVerniciafordii用手段，具有灵敏度高，特异性强，操作简单的特点，已经广泛应用于植物基因的表达研究领域。采用此技术，张丽娜等(2005)以小麦稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)作为对照，对与抗白粉病有关的小麦TaM-lo-A1c基因的表达进行了研究；蒋伦伟等(2012)分析了RAV基因家族在黄瓜各组织中的表达情况；张艳等(2012)采用该方法发现了三个水孔蛋白基因在幼苗根与糖分直接接触时明显上调；姚晓华等(2014)对青稞种子胚胎成熟晚期丰富蛋白(LEA)基因Hva1与青稞抗旱性的关系进行了分析。通常，RT-PCR实验会引入内参基因校正不同样本和实验条件带来的数据差异(Bustin,2002;Andersenetal.,2004)。为保证实验的准确性，需要选择在样品各种组织或发育阶段均能稳定表达的基因作为内参基因(胡瑞波等,2009)。本研究筛选出油桐种子表达分析内参基因GAPDH，，并以此为基础研究了桐酸合成关键基因FADX的表达模式，有助于桐油品质改良和油桐分子辅助育种的研究。1结果与分析1.1总RNA提取及cDNA第一链合成提取的油桐种仁总RNA经凝胶电泳检测(图1)，可观测到清晰的28s和18s条带，28srRNA条带基本为18srRNA条带亮度的2倍，表明提取的RNA完整性好，基本没有降解，可以用于其后的研究，另外，由于LiCl对小分子核酸尤其是tRNA的沉淀效果不好，5s的条带基本不可见。用紫外分光光度计测量提取的RNA样品的A230，A260，A280值，所有样品的A260nm/A230nm均在2.0~2.4之间，A260nm/A280nm在1.7~2.0之间，表明所提RNA质量符合要求，可以满足后续实验要求。反转录体系中RNA量均为3μg，通过调整起始RNA的量，以等量的TotalRNA反转录合成不同的cDNA样品之间可
分子植物育种MolecularPlantBreeding图24个内参基因的RT-PCR分析注:A:琼脂糖凝胶电泳图;M:DNAmarker;1~5分别表示7.11,8.10,8.21,9.9以及10.30五个时间点的油桐样品;B:QuantityOne数据分析;C:GeNorm程序数据分析表Figure2Analysisofthe4internalcontrolgenesNote:A:Agarosegelelectrophoresofthe4genes;M:DNAmarker;1~5:Thesamplecollectedin7.11,8.10,8.21,9.9and10.30;B:Analysisofthequantityonedata;C:DataforGeNormprogram步分析。GeNorm程序是专门用于RT-PCR方法选择内参基因的程序，可以从一系列不同功能的候选内参基因中选择出表达稳定度最高的内参基因，在内参基因的评价和筛选方面具有重要的作用(Vandes-ompeleetal.,2002)。在本研究中，我们利用GeNorm程序计算表达稳定度平均值(M)对4个内参基因表达稳定度进行了排序，最终确定了GAPDH为FADX基因在油桐种子不同发育时期RT-PCR半定量检测的内参基因。它是糖异生、糖酵解及光合作用碳固定循环过程中的关键酶，在生物进化的早期出现，是最为常用的内参基因之一(董晓丽等,2009,中国畜牧兽医,36(9):83-85)。前人对油桐果实生长发育规律的研究(蔺定运和倪善庆,1980,植物生理学通讯,(3):37-40;何方等,1988,中国油桐科技论文选,pp.422-426)表明，油桐脂肪酸的含量从5月底到8月中旬都是逐步上升的，只是增值幅度不大，含油量不到10%，从8月中旬开始，脂肪酸的含量开始急速上升，8月底就能达到40%。从本实验结果可以看到，在油桐果实的发育早期(7月至8月中旬)的样品中，FADX一直维持在较低的表达水平上，但是从果实发育中期(8月中旬)开始，FADX的表达显著上升且一直保持这一水平至果实净成熟阶段(10月底)，这也从一个方面证明FADX与油桐的油脂合成紧密相关?
【参考文献】
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本文编号：2583652
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