基因工程鲎素Tachyplesin I的工业化生产及其皮肤抗菌凝胶的研制

发布时间：2020-03-13 18:26

【摘要】：抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是两栖类、哺乳动物、鱼类等生物非特异性免疫防御系统的主要成分之一,具有广谱杀菌、抑制病毒、抑杀肿瘤细胞等作用。鲎素是一种宿主防御肽,具有很强的抗菌活性。本实验室成功构建了鲎素(Tachyplesin I)的组成型酵母表达菌株,并使用7.5L发酵罐成功表达出了高活性的基因工程鲎素。另外,对其体内外抗金黄色葡萄球菌活性进行了研究,并从是否能够调动机体的天然免疫功能等角度探讨了其与宿主同源肽之间的相互关系。本研究为了解决基因工程鲎素工业化生产问题,使用本实验室已构建好的酵母表达系统,对基因工程鲎素Tachyplesin I(TP I)进行工业化(150L)生产,并在此基础上对其皮肤抗菌凝胶进行研制。根据本研究要求,设计并安装了发酵设备、控制设备、辅助设备等。发酵设备采用15L-50L-150L三个发酵罐,两两相连;控制设备采用自动控制工作台,监测发酵过程相关参数;辅助设备包括空气压缩机、蒸汽发生机、冷冻水循环机等。对发酵工艺进行了摸索和优化,实现了基因工程鲎素的工业化生产。发酵过程使用普通高压空气,不通入纯氧;15L发酵罐为种子发酵罐,种子培养基使用YPD培养基,培养基填充量为7L,接种量为1:40,发酵时间为14h,转速200rpm/min,通气量为0.2m3/h;50L、150L发酵罐为诱导表达发酵罐,种子培养基使用改良BSM培养基,填充比例为60%,接种量为1:20,发酵时间为62h,转速分别为240rpm/min、160rpm/min,通气量分别为1.2m3/h、3.6m3/h;甲醇补料方式采用恒速流加甲醇,流速控制在2m L/L/h;温度控制在29℃;发酵过程中不补加酸液、碱液。以金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌,采用抑菌圈法检测其抑菌活性,抑菌圈超过26mm。通过高温、钴-60辐照灭菌后,其抑菌活性无明显下降,证明基因工程鲎素有作为外用药物制剂原料使用的潜力。进行了基因工程鲎素的皮肤抗菌凝胶的研制。使用上述发酵上清作为抑菌剂,配合中药提取物和其它辅料,制得抗菌肽凝胶。检测其抗菌活性,其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痤疮丙酸杆菌、链球菌、白色念珠菌等常见皮肤感染菌均有抗菌活性。进行溶血试验,该凝胶无溶血性和凝血性。对凝胶进行药物加速试验,在6个月的药物加速试验过程中,在第1、2、3、6个月取样检测,凝胶性状无可见变化,无沉淀和分层现象产生,p H值维持在5.5~6,粘度维持在5~5.5Pa.s,抑菌活性无明显下降,证明其可以通过6个月的药物加速试验。为了验证该凝胶的治疗效果,使用该凝胶治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(USA300菌株)感染的小鼠。结果表明,该凝胶具有加快创面愈合的功效,在治疗的第1天就使创面无渗出物产生,第2天开始出现结痂,其脱痂速度也是几组中最快的,这为抗菌肽作为外用药原料提供了实验依据。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ427.26;TQ460.1

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