Dnmt基因对褐飞虱翅型分化的调控及miRNA的靶向分析

发布时间：2020-03-15 04:53

【摘要】：褐飞虱(Nilaparvat lugens)是我国水稻上的重要害虫,食性单一,只能在水稻上取食和繁殖,成虫具有明显的翅二型现象,短翅型适宜于定居繁殖,长翅型具有远距离迁飞习性。本文通过Dnmt基因的dsRNA注射干扰、miRNA靶标预测及双荧光素酶报告基因体外验证等实验,发现DNA甲基化对褐飞虱翅型分化具有调控作用。1.干扰Dnmt基因对褐飞虱翅型分化的影响解剖了普通种群褐飞虱成虫的头、胸、中肠、脂肪体、卵巢和精巢6个组织,采用实时荧光定量PCR方法检测了褐飞虱不同组织DNA methyltransferase 1(Dnmt1)和DNAmethyltransferase3(Dnmt3)基因的表达水平。结果表明,Dnmtl和Dnmt3基因均在卵巢的表达量最高,卵巢与精巢中的表达量有显著差异。选取了刚羽化2天的短翅种群褐飞虱雌成虫进行注射干扰,注射完成后将褐飞虱放入带有水稻苗的烧杯中继续饲养,并放入50头刚羽化2天左右的短翅种群雄虫让其交配。统计后代成虫的长短翅型比例,发现注射dsDnmt3后短翅种群后代的长翅褐飞虱比例显著增加,注射dsDnmtl后无明显差异,表明Dnmt3参与的DNA从头甲基化参与调控褐飞虱的翅型分化。2.靶向Dnmt基因的miRNA预测利用miRanda、TargetScan、microTar、PITA、RNAhybrid五个miRNA靶标预测软件对可能靶向Dnmt基因的miRNA分别进行预测,然后利用在线网站对五个软件的预测结果取交集来缩小靶向靶基因的miRNA选择范围,减小误差。结果表明,对Dnmtl基因,五个软件都预测到靶向的miRNA有1个,四个软件都预测到靶向的miRNA有2个,三个软件都预测到靶向的miRNA有5个。没有miRNA被五个软件都预测到靶向Dnmt3基因,四个软件都预测到靶向Dnmt3基因的miRNA有1个,三个软件都预测到靶向Dnmt3基因的miRNA有2个。3.靶向Dnmt基因的miRNA表达分析选取了部分靶向Dnmt1和Dnmt3基因的miRNA(miR-124、miR-263a、miR-263b、miR-980)进行表达分析,检测了这些miRNA在褐飞虱长短翅两个种群1龄至5龄若虫阶段的表达水平。结果表明,其在若虫阶段存在不同程度的表达差异。miR-124基因在长翅型种群若虫1龄、5龄、羽化后第四天雄成虫的表达水平均明显高于短翅型种群;miR-263b在若虫1龄、2龄、5龄、羽化后第四天的雄成虫阶段的表达水平也存在显著差异;miR-980仅在若虫1到4龄阶段中长翅种群表达水平明显高于短翅型种群。4.miRNA靶向Dnmt的双荧光素酶验证构建了Dnmt 和Dnmt3基因的双荧光素酶报告基因载体,对部分软件预测结果进行了实验验证。结果显示,与对照相比,褐飞虱中miR-263a、miR-263b、miR-279-5p对带有靶标基因Dnmt1 3'UTR的luciferase表达具有极显著的抑制,表明miR-263a、miR-263b、miR-279-5p在体内可能对Dnmtl具有极显著的负调控作用。褐飞虱中miR-2a、miR-87a对带有靶标基因Dnmt3 3'UTR的luciferase表达具有显著的抑制,表明miR-2a、miR-87a在体内可能对Dnmt3具有显著的负调控作用。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.112.3

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本文编号：2587119