番茄高亲和磷转运蛋白基因SlPT1表达载体的构建和功能分析

发布时间：2020-03-19 05:12

【摘要】：磷在植物生长发育中起着关键的作用,大量营养元素中磷的缺少会影响到植物生长的各个环节。磷素在土壤中的含量很多但是可利用的却很少,为了应对这些环境条件的制约,植物进化出了自己的磷素利用系统。磷转运蛋白PHT1家族对磷的吸收和利用起到了关键作用,在磷胁迫的条件下,大多数的磷转运蛋白基因都进行了大量表达来提高细胞体内的磷素含量。番茄(Solanum lycopersicum)是主要蔬菜栽培作物,缺磷可引起番茄的产量和品质下降,研究番茄高亲和磷转运蛋白SlPT1基因的功能可以帮助解决番茄对磷素的利用。本课题构建了SlPT1基因的过表达载体对拟南芥突变体进行遗传转化,验证其在拟南芥突变体中的功能。对SlPT1基因启动子进行了克隆,并对其特性进行初步研究。具体实验结果如下:1.通过NCBI在线查找番茄基因数据库,获得了番茄SlPT1基因的序列,分析定位开放阅读框并进行设计引物,PCR扩增获得了一条长为1654bp的片段序列。通过Blast基因序列比对与氨基酸序列比对进行分析,番茄磷转运蛋白基因SlPT1的全长为2002bp(GenBank ACCESSION NM_001247432),开放阅读框为1617bp,编码一个538个氨基酸的蛋白质。番茄SlPT1基因编码的磷转运蛋白的分子式为:C_(2716)H_(4137)N_(673)O_(722)S_(29)。氨基酸的组成成分表2.6,分子量:58699.54D,等电点为8.51,平均亲水系数0.401,不稳定系数29.20。番茄SlPT1与拟南芥AtPT4有高同源性。2.将扩增克隆得到的SlPT1基因连接到T-Vector pMD 19载体上并转化大肠杆菌,然后进行测序。将测序正确的提取质粒,SlPT1-T质粒和pCAMBIA3301/Luc载体质粒用分别用XbaⅠ和XmaⅠ限制性内切酶进行处理,然后进行连接转化,将构建的表达载体命名为SlPT1-pCAMBIA3301/Luc。3.用农杆菌介导的蘸花法进行遗传转化拟南芥突变体,筛选并获得了转基因植株,进而获得T1代种子。进而对T1代植株进行表型观察,相比于对照植株,转基因植株在正常培养条件下未出现缺磷症状差异不明显,但是根部形态变化明显。转基因植株提高了磷的吸收,在正常培养条件下高于对照,缺磷情况下和对照相比不明显。4.扩增获得了一条903bp大小的启动子序列,在线进行序列分析和顺式作用元件预测。将克隆得到的片段连接T-Vector pMD 19载体测序,将SlPT1-Pro-T质粒和pBI121载体质粒用酶切位点HindⅢ到XmaⅠ进行双酶切,连接转化并验证,构建完成替换CaMV35S启动子的表达载体。通过对拟南芥的瞬时表达,根据对照比较及其染色效果分析,SlPT1基因启动子在根部活性明显。综上所述:构建完成了表达载体SlPT1-pCAMBIA3301/Luc。对转基因植株处理,进行表型观察,相比于对照植株转基因植株在正常培养条件下未出现缺磷症状差异不明显但是根部形态变化明显。转基因植株提高了磷的吸收,在正常培养条件下高于对照,缺磷情况下和对照相比不明显。SlPT1基因启动子对拟南芥的转化,进行了初步研究,SlPT1基因启动子在根部活性明显。
【图文】：

PCR扩增,菌液,特异性引物,甘油

骤：5℃2 min4℃30 s60℃30 s 共 30 个循环72℃2 min72℃5 min 4℃+∞泳检测确认。将条带正确的菌液，，吸取 3余菌液加无菌的甘油放入-80℃保存。为模板，利用特异性引物扩增 SlPT1 基，与预期片段大小相符（图 2.1）。

质粒图谱

图 2.2 T- Vector pMD 19 质粒图谱Fig. 2.2 T- Vector pMD 19 plasmid map图 2.3 转化大肠杆菌蓝白斑筛选Fig. 2.3 Transform E. coli blue and white spot screening
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S641.2

【参考文献】