去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠模型的构建及表型初步分析

发布时间：2020-03-19 15:21

【摘要】：蛋白质的泛素化是一种可逆的翻译后修饰,参与了细胞内一系列生理反应,包括蛋白质降解、细胞信号转导、表观遗传修饰、细胞定位等,并且与多种疾病的发生发展密切相关。去泛素化酶(DUBs)是泛素化修饰的负向调节因子,理解去泛素化酶的功能和作用机制是目前的研究热点。目前已知的去泛素化酶主要包括UBP/USP家族、UCH家族、OTU家族、JAMM家族、MJD家族和MCPIP家族。其中,OTU家族作为去泛素化酶中的第二大家族,在DNA损伤修复、炎症免疫应答、代谢稳态维持、肿瘤发生发展等多个方面发挥着重要的功能。目前人源OTU家族共发现16个具有去泛素化酶催化活性的成员,主要可分为Otubains、A20-like OTUs和OTUDs三个亚家族,该家族成员主要通过高度保守的OTU结构域行使其去泛素化酶的催化活性,且该家族成员对底物的去泛素化修饰具有链型特异性。OTUD4是OTUDs亚家族中的一个成员,目前已报道的去泛素化酶OTUD4修饰的底物泛素链类型有K48型泛素链和K63型泛素链。其中,OTUD4可通过自身第202位和204位丝氨酸的磷酸化来激活其去泛素化酶活性,从而去除TLR信号通路关键接头蛋白MyD88的K63型泛素链,进而实现对先天免疫的稳态调节。此外,OTUD4还可以酶活非依赖的方式调节DNA去甲基化酶ALKBH2和ALKBH3的蛋白稳定性,进而促进DNA的烷基化损伤修复。有研究发现伴随有共济失调和低促性腺素症患者体内Otud4基因存在非酶活突变,Otud4基因突变是否是导致这一综合症的主要原因及其调控这一综合症的功能机制是什么仍然未知。为了深入探究OTUD4的生理功能,我们通过Cre-Loxp策略构建了去泛素化酶OTUD4基因敲除小鼠模型,并对该小鼠模型进行了初步的表型分析。我们目前的研究结论主要有:1.Otud4基因敲除后,Otud4~(-/-)小鼠能够正常出生和存活,并且其出生率符合孟德尔遗传规律;此外,与同窝Otud4~(+/+)小鼠相比,Otud4~(-/-)小鼠在体型、体重等方面均没有显著性差异;2.通过解剖发现,与同窝Otud4~(+/+)小鼠相比,Otud4~(-/-)小鼠的大脑、小脑、胸腺、肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏在重量上均没有统计学差异;3.小鼠组织病理学分析发现,Otud4~(-/-)小鼠的大脑、小脑、肺、心脏、肝脏、肾脏、脾脏并无明显的病理学异常;4.对同窝Otud4~(+/+)小鼠和Otud4~(-/-)小鼠进行血象分析和血糖监测发现,Otud4~(-/-)小鼠的血象和血糖也均正常。OTUD4究竟具有哪些生理功能,我们仍然还需探索。综上所述,我们采用Cre-Loxp策略首次构建了去泛素化酶OTUD4的基因敲除小鼠模型并对其表型进行了初步分析。我们的研究发现,Otud4基因敲除后,Otud4~(-/-)小鼠能够正常出生和存活,并且主要组织器官并没有明显病理学异常,小鼠血液中的成分和血糖浓度也均正常。Otud4基因敲除小鼠模型的成功构建为进一步探究去泛素化酶OTUD4的生理功能奠定了基础。巨噬细胞是机体内重要的免疫细胞,其分布于全身的各个组织中,在机体的免疫反应中发挥着重要的功能。巨噬细胞具有较强的异质性和可塑性,即巨噬细胞在不同的组织中具有不同的形态和功能,在不同的刺激条件下,巨噬细胞的表型也存在差异。通常,人们将巨噬细胞按功能划分为经典激活的巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和非经典激活的巨噬细胞(M2型巨噬细胞)。在炎症反应过程中,M1型巨噬细胞通常被促炎细胞因子IFN-γ或其他微生物产物(如LPS)激活,从而呈现促炎表型,而M2型巨噬细胞通常被抑炎细胞因子如IL-4、IL-13、IL-10以及TGF-β激活,从而呈现抑炎表型。M1型和M2型是巨噬细胞极化的两个极端。巨噬细胞极化的激活和失活在免疫和炎症反应中发挥着重要的功能,目前有关调控巨噬细胞极化的分子机制研究还很有限,因此,鉴定更多调控巨噬细胞极化的分子对于更好了解巨噬细胞功能的发挥具有重要意义。CKIP-1是一个含PH结构域、与细胞骨架相关的蛋白,其参与调节细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等众多生物学过程。我们的研究发现CKIP-1是调控巨噬细胞极化的一个分子开关,其受M1和M2极化经典刺激信号的调节,并且反过来可以通过负反馈回路同时调节M1和M2型巨噬细胞极化。首先,我们通过筛选发现CKIP-1在小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDM和腹腔巨噬细胞PM中均高表达;其次,我们发现在促炎M1刺激物(如LPS和IFN-γ)诱导下,CKIP-1在人源和鼠源BMDM中表达增加,而在抑炎M2刺激物(如IL-4和IL-13)诱导下,CKIP-1在人源和鼠源BMDM中表达下调。此外,在生理上,我们发现巨噬细胞特异性CKIP-1缺失对抑制体内TPA诱导的皮肤炎症是不可或缺的。以上研究表明,CKIP-1是一种新的调控巨噬细胞极化的关键分子。
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q75

【相似文献】