两种石磺背部皮肤蛋白质组及细胞凋亡相关基因表达差异分析

发布时间：2020-03-19 20:42

【摘要】：国际上对石磺科贝类的系统分类研究开始较早,国内对石磺的研究已从形态分类研究扩展到系统进化及资源利用等方面。角质层位于皮肤的表面,是生物防御外界物理伤害和化学伤害的重要屏障。本研究选取有代表性的以陆栖为主的瘤背石磺和以水栖为主的里氏拟石磺的背部皮肤为研究对象,对皮肤为适应环境表现出蛋白质层面的差异做进一步探索;通过对两种石磺背部组织染色观察和蛋白质组测定分析,得到两种背部皮肤组织结构差异明显的石磺在蛋白层面的差异、相关蛋白筛选与功能验证及基因表达分析结果:(1)两栖性生物皮肤对自身生存和适应栖息地的环境变化起着无可替代的作用,从两种石磺背部皮肤组织切片的TUNEL染色观察到瘤背石磺背部凋亡信号多于里氏拟石磺,且凋亡信号多集中分布靠近表皮部位,背部乳头状突起,凋亡信号明显。推测里氏拟石磺明显的蜕皮现象要求不断有新的细胞生成,瘤背石磺背部皮肤虽不蜕皮但同样有细胞分裂分化现象,从而机体为了维持体内细胞平衡状态,诱导大量细胞凋亡信号的发生。(2)采用Label-free非标定量研究方法,对瘤背石磺和里氏拟石磺背部皮肤组织进行蛋白质组学鉴定及分析,鉴定得到较多的是胶原家族蛋白,说明石磺科贝类有较高的营养价值,经济价值潜力突出;差异分析得出两种石磺嘌呤代谢通路有较多的差异表达同源序列。定量分析显示,两种石磺背部皮肤差异同源蛋白种类和数量均较多,差异同源蛋白与其不同性状联系紧密,同时参与多种通路的分子调控中。差异蛋白中维生素C和富含血红素的白蛋白在里氏拟石磺背部皮肤中高表达,这类蛋白在里氏拟石磺背部皮肤的呼吸作用和渗透压调节等功能中发挥重要作用。其中差异同源蛋白多富集在糖酵解/糖质新生和丙酮酸代谢通路,糖酵解/糖质新生通路存在较多差异同源序列,表明两种石磺背部组织能量代谢过程存在差异,数据分析显示糖酵解/糖质新生过程关键酶己糖激酶在里氏拟石磺中高表达,能够保证充分的能量供应、促进细胞增殖,可知里氏拟石磺背部皮肤糖酵解能力较强,与蜕皮(角质膜更换)频繁,需要较多的能量支持和较快的细胞增殖现象相关。瘤背石磺背部皮肤角质化程度较高,脂质基质的主要成分神经酰胺类物质在瘤背石磺中高表达,神经酰胺是各种细胞因子和生长因子信号通路重要的第二信使,并且在皮肤渗透压调节通路中发挥重要作用,对皮肤保湿有重要贡献,是瘤背石磺适应陆栖生活的一个重要体现。在细胞凋亡功能富集中发现,与促进细胞增殖、抑制细胞凋亡相关的蛋白在里氏拟石磺背部皮肤中高表达,与TUNEL染色法观察到里氏拟石磺背部组织凋亡信号较弱现象吻合。两种石磺背部嘌呤代谢通路存在较多的差异同源序列,在动物从水生到陆生的进化过程中,尿素酶基因在陆生动物中完全消失,或蛋白失去活性;两种石磺的转录组和蛋白质组差异分析显示,尿素酶基因和蛋白在瘤背石磺中高表达,前期实验证明里氏拟石磺分泌的粘液中尿素含量远高于瘤背石磺,说明瘤背石磺在嘌呤代谢通路产生的尿素大部分被尿素酶分解,更偏向于水栖生物的特征,属于特殊物种,推测是与受到外界刺激时瘤背石磺以分泌粘液和散发出刺激性氨气为主,而里氏拟石磺以喷射粘液为主的现象相关。(3)采用RACE方法,首次于瘤背石磺中得到Os-PAK2、Os-14-3-3序列全长,在里氏拟石磺中得到Pr-14-3-3序列全长。Os-PAK2氨基酸位置29-64是典型的PBD(P21结合位点),位置222-473是丝氨酸/苏氨酸结构,具有自我磷酸化调控作用,是调节PAK活性的主要部位。荧光定量分析显示,瘤背石磺PAK2背部组织的表达量在mRNA和蛋白质水平均高于里氏拟石磺,结合TUNEL染色结果,推测瘤背石磺背部皮肤组织中Os-PAK2促进凋亡的作用更加明显。瘤背石磺各组织中Os-14-3-3的qRT-PCR定量分析显示,在肠道和神经组织中表达量远高于里氏拟石磺,推测瘤背石磺适应陆栖生活的条件下肠道和神经组织活跃度降低,组织细胞更新速率比里氏拟石磺慢。Pr-14-3-3在里氏拟石磺的背部和腹足组织表达量高于瘤背石磺,推测里氏拟石磺背部组织的细胞不断增殖分化,且细胞凋亡信号受到抑制,以保证在角质膜频繁更换的同时不断有新的细胞补充。瘤背石磺和里氏拟石磺在长期的系统进化过程中各自形成了背部皮肤对环境的适应,本研究对两种石磺背部皮肤的差异蛋白和两栖适应性有了更深入的了解,为全面分析两个近缘物种的环境适应性提供了蛋白组学的基础数据及部分候选蛋白,为深入研究石磺科贝类的趋异进化提供了有力参考。
【图文】：

石磺,活体,背石,里氏

图 2-1 两种石磺活体背面观和腹面观Fig. 2-1 Dorsal view and ventral view of Onchidium struma and Paraoncidium reevesi1. 瘤背石磺（Onchidium struma） 2. 里氏拟石磺（Paraoncidium reevesii）2016 年 7 月，采集成体瘤背石磺和里氏拟石磺（广东湛江），在实验室养箱中暂养，，取东海滩涂底泥铺在箱底，营造石磺适宜生存的环境，投喂玉米粉，喷洒千分之五的人工海水，保持养殖箱中的湿度。表 2-1 两种石磺实验样品信息（n=3）Tab. 2-1 Specimens information of Onchidium struma and Paraoncidium reevesii

石磺,背石,里氏,组织切片

上海海洋大学硕士学位论文参照TUNEL FITC Apoptosis Detection Kit（南京诺唯赞公司）产品说明书，需要注意的是Proteinase K溶液孵育时，室温下25 min；滴加1 ×Equilibration Buffer孵育样本时，室温30 min；使用DAPI在暗环境中染色，结束后立即在荧光显微镜下检测拍照。1.2.3 组织观察用电光学显微镜 Nikon Eclipse Ni 观察 HE 染色组织切片。TUNEL染色组织切片置于尼康 55i 荧光显微镜下观察。2 结果与分析2.1 HE 染色组织切片观察
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】