猪粪便不同温度厌氧发酵过程中抗生素耐药基因的变化机理研究

发布时间：2020-03-20 09:22

【摘要】：随着抗生素的大量使用,抗生素耐药性问题已成为一个日益严重的人类健康威胁,因而控制耐药菌的产生和传播至关重要。由于在畜禽类动物的养殖过程中常常添加抗生素,使得动物粪便成为抗生素耐药性的重要源头。抗生素耐药基因(ARGs)是一种新型的环境污染物,可通过水平基因转移在不同的细菌之间传播耐药性。动物粪便中携带的大量ARGs进入环境之后,可能通过耐药性的传播最终加速耐药致病菌的产生。厌氧发酵是常用的粪便处理方法,且对ARGs具有一定的去除效果。本课题的目的是探究厌氧发酵过程中影响ARGs去除率的因素和机制,为彻底减少厌氧发酵过程中的ARGs输出提供理论依据。温度作为影响厌氧发酵的主要因素之一,会对ARGs的去除率产生影响。本课题采用猪粪便为发酵底物,在不同的粪便化学需氧量(COD)浓度(0.4,1.2,2,5 g/L)下分别进行低温(22℃)、中温(37℃)和高温(55℃)厌氧发酵,使用宏基因组测序方法研究了厌氧发酵过程中ARGs、微生物和质粒的动态变化趋势,并比较不同发酵条件对ARGs去除率的影响,以及ARGs与潜在宿主菌、质粒之间的相关性。此外,本课题还依据文献选取在猪粪便中普遍存在的4个ARGs,使用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)进行检测,比较了宏基因组测序和qPCR方法在ARGs检测中的优缺点。得出的主要结果和结论如下:在猪粪便中,含量最丰富的ARGs为四环素类ARGs,占所有检测到的ARGs含量的58%,其次是氨基糖苷类(15%),MLS类(大环内酯—林可酰胺—链阳菌素B)(15%)和磺胺类(10%),此4类ARGs合计占总ARGs的98%。这与养猪业中常用的抗生素种类相符。对于单个ARGs而言,tet36的含量最高(13.6%),依次递减为tetW(10.0%),tetQ(9.1%),sul2(8.7%)和tetX(6.0%)等。对于ARGs的去除,高温显示出较好的整体效果。但在不同COD浓度的厌氧发酵过程中,温度对ARGs去除率的影响不完全一致;因此,COD对ARGs的去除有所影响。低浓度下(0.4和1.2 g/L),高温更有助于ARGs的去除。而在COD浓度为2 g/L时,37°C的去除率高于55°C。浓度为5g/L时,37℃与55°C的去除率相同。在55℃发酵中,当COD浓度为2 g/L时,一些基因在第12天降至最低,第16天时却有回升,包括tetW、sul2、tet44、tetL等。表明发酵时间的长短也会影响ARGs的去除。发酵过程中大部分ARGs的含量随着时间的推移而降低,且发酵第4天发生明显的下降。同样,微生物丰度在第4天发生剧烈变化,表明微生物菌群的变化是影响ARGs含量的重要原因。通过分析ARGs和微生物菌群之间的相关性,表明主要的宿主菌是Bacteroides propionicifaciens,Pseudomonas caeni,Lactobacillus spp.和Bifidobacterium pseudolongum。在所有的ARGs中,分布最广的为tetW和tet36。本课题还首次分析了厌氧发酵过程中,质粒与ARGs变化的关系,表明了质粒在ARGs去除中的重要作用。总体而言,来自变形菌门的质粒更容易携带ARGs,因此变形菌是猪粪便中要着重去除的细菌。在4种ARGs的检测中,分别用qPCR和宏基因组检测二种方法测得的基因丰度不一致。但这两种方法所测得的基因的变化趋势较为一致。上述结果表明qPCR在检测过程中,可能会由于引物扩增偏差而导致不能很好地比较不同基因之间的丰度,但可用于比较同一基因相对变化情况。综上所述,猪粪便中含有丰富的ARGs,高温厌氧发酵能较好的去除猪粪便中的ARGs。温度、COD和发酵时间都是影响ARGs去除的重要因素。这些影响因素是通过影响微生物菌群及其携带质粒的变化起作用的。本课题的研究结果可为猪粪便厌氧发酵参数的优化提供参考,也让我们对猪粪便厌氧发酵中去除ARGs的机制有了更深入的了解,并对研究其他类型的厌氧发酵有启示作用。
【图文】：

图 1.1 重要耐药事件发生的时间表[2]Figure 1.1 Timeline of key antibiotic resistance events日期基于最早的文献报道。对于多重耐药不动杆菌和假单胞菌，其日事件暴发的报道。2.青霉素于 1928 年发现，但在 1943 年广泛使用之素的使用受到限制。耐药性的生物学机制

图 1.2 抗生素耐药性的水平传播途径[21]。 Abr=抗生素耐药性Figure 1.2 Mechanism of horizontal transfer of antibiotic resistance等（2016）分析了超过 23 000 个细菌基因组中 ARGs 的存在特征[22] ARGs 主要存在于四个细菌门：变形菌门(Proteobacteria)，厚壁tes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)，并且在变形集[22]。所有含超过 40 种移动性 ARGs 的细菌全部来自变形菌门。另中的 ARGs 转移是最活跃的。其原因可能是许多人类病原菌来自于而可能经历更多的抗生素选择压力。研究进一步证实了近 70％的已Gs 与移动原件基因共存，这表明移动元件在促进 ARGs 的转移中发种水平上进行分析，四环素耐药基因 tetM 和 tetQ 以及磺胺耐药基因广泛的转移性 ARGs，，而在属水平上则是 tetC、tetW 和 sul1。究 ARGs 的分子生物学方法PCR 和实时定量 PCR 技术
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X713

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本文编号：2591587