重组尿酸酶基因工程菌的构建与表达及应用模型的筛选

发布时间：2020-03-21 01:09

【摘要】：高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)是以尿酸(uric acid,UA)升高为主要特征的一组疾病,不仅引起痛风,而且有研究表明HUA可能是胰岛素抵抗、血脂异常、高血压、脂肪肝、慢性肾病等多种代谢相关性疾病和心血管疾病发生发展的独立危险因素;且血清尿酸(serum uric acid,SUA)升高伴发的相关危害程度的广泛性,已经成为威胁全人类生活质量的一大健康隐患,对于HUA的防治和基础研究已成为热点之一。目前研究显示,致HUA的主要原因是,UA排泄减少;UA是人体内嘌呤代谢的终产物,在正常状态下,体内2/3的UA经肾脏排泄,约1/3的UA经肠道排泄。但是由于UA自身有限的水溶性,使其在通过肾脏的排泄时易引起泌尿系尿酸性结石;且目前临床上,治疗HUA和痛风的药物副作用极大;增加肠道的尿酸排泄量,为人类降低SUA提供了新的思路。尿酸酶能催化UA分解为CO_2、H_2O_2和尿囊素,而人类尿酸酶基因在进化过程中存在无义突变,机体缺乏该酶,使人体内UA不能进一步氧化分解,在某些病理情况下,由于嘌呤代谢紊乱,血液中UA积累过多,会导致HUA,继而引发痛风。本实验拟构建携带尿酸酶基因的工程菌株,并在尿酸酶N端引入信号肽使其在细胞外进行表达,加速肠道UA的分解,发挥降UA作用;同时建立不同类型的HUA大鼠模型,为后续工程菌株的应用奠定基础。1.构建重组尿酸酶表达菌株。以本实验保存载体(携带尿酸酶基因)为模板,PCR扩增suox(SPA信号肽+尿酸酶编码基因),并将其克隆至pMG36e(大肠杆菌-乳酸菌的穿梭载体)中,即pMG36e-suox。同时合成spo(乳酸菌信号肽)将其与uox(尿酸酶基因)连接后克隆至pMG36e中,即pMG36e-spo-uox。测序鉴定两种载体。测序结果与GenBank查询结果一致。2.重组尿酸酶的表达。将测序正确的含pMG36e-spo-uox、pMG36e-suox的BL菌株,扩大培养后,分别检测两表达载体于不同时间点在周质空间、上清液及包涵体蛋白表达量。结果pMG36e-spo-uox、pMG36e-suox成功在细胞外表达,且在9h获得最大表达量。3.单纯果糖喂养和氧嗪酸钾联合果糖建立高尿酸血症大鼠模型的比较研究。利用随机数字表法,将60只雄性SD大鼠平均分为6组,即5%Fru组(单用5%浓度的果糖喂养)、5%FPO组(用5%果糖+氧嗪酸钾处理)、10%Fru(单用10%果糖喂养)、10%FPO组(10%果糖水+氧嗪酸钾处理)、PO组(单用氧嗪酸钾处理)、Con组(空白对照组,单用清水饲喂);实验建模14w;每周检测大鼠SUA、血清尿素氮(serum urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum Creatinine,SCr)水平,并在实验结束后,采集大鼠肝肾组织,观察其组织学变化情况。结果在较短时间内,5%Fru组、10%FPO组、10%FPO组均能迅速升高SUA(P0.01);10%Fru组SUA水平不稳定,在第10w、11w SUA水平明显下降,显著低于5%FPO组、10%FPO组(P0.01)。在第6w,10%果糖处理组BUN水平开始升高(P0.01),在第7w SCr水平开始升高(P0.01)。10%果糖处理组可见肾脏组织学改变,5%FPO组偶见轻微肾脏组织学改变,其余各组未见肾脏组织学改变;未见各组大鼠肝脏有明显组织学变化。果糖联合氧嗪酸钾能够快速建立稳定的HUA大鼠模型,不同浓度果糖对肾脏改变状态不同,根据后续研究需要选择相应的模型。
【图文】：

uoxPCR反应结果

重组尿酸酶基因工程菌的构建与表达及应用模型的筛选

suoxPCR反应结果
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R589.7

【参考文献】