大豆Gmpm13基因的克

发布时间：2020-03-21 04:19

【摘要】：油体钙蛋白因其具有EF-手型结构域被归类为钙离子调节蛋白,它在植物发展过程及应激反应中扮演着非常重要的角色。在目前的研究中,研究者发现caleosin能够参与单层磷脂层和油体的锚定结合,在增加种子油体的稳定性上起着至关重要的作用。油体钙蛋白N-端结构域含有EF-Hand结构,可以结合1个Ca~(2+),C-端结构域含有磷酸化位点,推测caleosin可能参与由钙离子调控的信号转导途径,并且与植物耐受干旱胁迫存在必然的联系。本研究从吉育72号大豆中克隆了Gmpm13基因并对其在田间实验材料、干旱胁迫及原核生物中的表达进行了初步的分析,为大豆caleosin蛋白在植物基因工程、生物技术及生物化学上的应用提供科学的依据,主要结果如下:1、通过RT-PCR法克隆了大豆Gmpm13基因,获得一个全长为885bp的cDNA序列,包括一个720bp的开放阅读框,编码239个氨基酸;并通过在线软件对基因序列进行分析,确定Gmpm13基因分布在10号染色体上,理论等电点为5.15,没有同源基因和信号肽,在59-228个氨基酸处有一个EF-手型结构域、在63-92个氨基酸处有一个caleosin结构域,在92-115个氨基酸处有一个跨膜区。通过设计带有酶切位点的引物克隆得到全长为738bp的油体钙蛋白基因,它编码的蛋白大小为27.1kDa,并与原核表达载体pET-28a连接,命名为pET-28a-pm13,并对其原核表达体系进行优化,结果表明在28℃,1.5mmol/L IPTG浓度下诱导12 h达到蛋白的最大表达量,占总蛋白的39.25%。2、通过实时荧光定量PCR的方法对田间实验材料不同生育时期(苗期、分枝期、开花期、结荚鼓粒期、成熟期)、不同器官(根、叶片和种子)Gmpm13基因相对表达水平进行测定,发现随着生育时期的变化,根和叶片中基因的表达水平呈先升后降趋势,在结荚鼓粒期最高分别为0.0631和0.3294;种子中基因表达水平逐渐增加,完熟期达到最高值0.0378。采用紫外分光光度法对游离氨基酸、可溶性蛋白含量进行测定,发现随着生育时期的变化,游离氨基酸含量在根和叶片中呈先升后降趋势,在结荚鼓粒期达到最高,分别为38.3867μg/g和19.4143μg/g;可溶性蛋白含量变化趋势与游离氨基酸相同,最高值分别为0.0358mg/g和0.0524mg/g;在种子中可溶性蛋白含量逐渐升高,完熟期达到最高0.8763mg/g,游离氨基酸含量先升高后降低,最高值为54.3827μg/g。3、对干旱胁迫处理的(PEG6000的浓度分别为0、5%、10%、15%、20%、25%,分别胁迫1-6天)苗期大豆叶片Gmpm13基因的相对表达水平进行测定,发现随着胁迫时间和浓度的增加,基因表达水平呈先增后降趋势,在PEG6000浓度为20%胁迫4天时达到最高值17.248。采用比色法和紫外分光光度法检测抗氧化酶(SDO、POD、CAT)活性和膜质过氧化产物(MDA)含量,发现随着胁迫时间和浓度的增加,POD、CAT和SOD活性呈先升后降趋势,SOD和POD活性在胁迫浓度为15%胁迫3天时达到最高值,分别为7329.62u/mg(蛋白)和2191.43u/(g·min),CAT活性在胁迫浓度为15%胁迫4天时达到最高值148.347u/(g·min);MDA含量逐渐升高,在胁迫浓度为25%胁迫6天时达到最高值116.775μmol/g;采用磺基水杨酸法对渗透调节物质(Pro)的含量进行测定,结果发现Pro含量随时间增加逐渐增加,随浓度的增加呈先增后降趋势,在胁迫浓度为15%胁迫6天时达到最高值316.602ug/g。
【图文】：

大豆种子,模板,片段,产物

电泳检测大豆种子总 of total RNA in soybean0 Marker; 1: 总 RNA; 1:，并以此为模板进行，与预测片段大小一M 1 2000000p.2 PCR 扩增 Gmpm13PCR amplification of Gm1、2：均为 PCR 产物

大豆种子,基因,模板,片段

5002 0001 000750250100M 1bp2.1 电泳检测大豆种子tion of total RNA in soyb000 Marker; 1: 总 RNAA，并以此为模板进），与预测片段大小M 1 2
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.1;Q943.2

【参考文献】