【摘要】：目的:套细胞淋巴瘤(MCL)是一种侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL),预后差,中位生存期仅3-5年。MCL同时也是一种异质性疾病,并非所有病例都呈侵袭性,约10-15%的MCL患者表现惰性病程。因此有必要探索MCL新的分子遗传学标记及预后因素为治疗策略提供依据。MCL特征性的分子学标志为t(11;14),导致了CCND1的高表达。预后因素目前国际最为常用的是套细胞淋巴瘤国际预后指数(MIPI)。此外,研究显示P53基因异常与MCL患者的不良预后相关,常见的P53基因异常包括基因突变和缺失,研究显示P53基因突变和P53蛋白高表达高度相关,因此可检测蛋白表达反映基因突变情况。研究显示有预后意义的另一指标是SOX11,但其在MCL中的预后价值结论不一致,部分研究显示SOX11高表达与良好预后相关,也有研究结论与之相反,提示可能存在复杂的混杂因素。研究显示多种miRNA通过调节靶基因的表达在淋巴瘤的发生发展中在起着重要作用,并影响疾病的预后。其中,miR-17-92,mi R-155,miR-150和miR-34a异常表达是B细胞肿瘤发生过程中的共同事件,miR-34a通过FOXP1及BCL2参与抑癌基因P53的调节网络,从而影响B细胞的分化和凋亡,在弥漫大B细胞淋巴瘤(BLBCL)等淋巴瘤中低表达并与预后相关。miR-155是第一个被证实可导致淋巴瘤发生的mi RNA,miR-155高表达与单克隆B淋巴细胞增多症(MBL)向CLL转化、CLL患者差的治疗反应、短生存期相关。本研究通过检测75例MCL患者SOX11mRNA、miR-34a和mi R-155-5p表达以及P53基因异常,探讨SOX11mRNA、miR-34a和miR-155-5p表达与P53基因异常和病理分型、分期、免疫表型、MIPI等预后指标的相关性,并研究其对生存的影响,以阐明SOX11mRNA、miR-34a和miR-155-5p表达和P53基因异常在MCL中的临床价值。方法:1.采集75例MCL患者的详细临床资料,所有病例均进行电话随访,中位随访时间40(2-98)月。2.全部病例根据收集到的临床资料重新复核MIPI,应用国际通用的简化sMIPI公式计算。3.使用组织阵列点样仪制备组织芯片。4.免疫组化的方法检测75例MCL的CCND1、Ki67、SOX11、P53的表达情况。5.荧光原位杂交的方法检测75例MCL P53基因缺失情况。6.DNA测序法检测25例MCL患者P53基因exon5-9的突变情况。7.荧光定量PCR的方法检测75例MCL SOX11m RNA的表达水平。8.应用生物信息数据库TargetScan及miRdb预测可能调节SOX11基因表达的miRNA。9.荧光定量PCR的方法检测75例MCL患者miR-155-5p和miR-34a的表达水平。10.多种统计学方法分析MCL患者SOX11mRNA的表达情况,SOX11mRNA与临床病理特征和P53基因异常的相关性,MCL患者SOX11m RNA表达和P53基因异常的生存分析;MCL患者miR-155-5p和miR-34a的表达情况,miR-155-5p与临床病理特征和SOX11mRNA的相关性,miR-34a与临床病理特征和P53表达的相关性,MCL患者miR-155-5p和miR-34a表达的生存分析。结果:1.临床特征:75例MCL患者中,男58例(77%),女17例(23%),发病年龄39-79岁,中位年龄63岁。诊断时ECOG2-4分48例(64%),Ann Arbor分期Ⅲ~Ⅳ期56例(75%),有B症状13例(17%),骨髓受侵22例(29%)。外周血白细胞≥10×109/L11例(15%),乳酸脱氢酶(LDH)升高者17例(23%),β2微球蛋白(β2-MG)升高者35例(47%)。MIPI低危组21例(28%),中危组31例(41%),高危组23例(31%)。2.病理形态学及免疫表性特征:形态表现为经典套细胞型69例(92%),发生母细胞转化6例(8%)。免疫组化阳性率依次为CyClinD1 100%(75/75),bcl-2 97%(66/68),CD5 82%(60/73),CD23 21%(15/72),Bcl-6 12%(8/69),Ki67≥30%29%(22/75)。SOX11+97%(73/75);。3.TP53基因异常:基因异常(突变和缺失)16/75(26%)例。4.荧光定量PCR检测SOX11mRNA的表达:MCL患者SOX11mRNA水平3.097(1.311,6.216),对照组1.058(0.302,2.623),MCL患者SOX11mRNA的表达水平明显高于淋巴结反应性增生患者(p=0.00015)。5.SOX11mRNA表达与临床病理特征及P53基因异常的相关性:5.1 SOX11mRNA表达与临床病理特征的相关性SOX11mRNA表达水平在ECOG2分、骨髓正常的患者分别高于ECOG≥2分(P=0.0011)、骨髓浸润(P=0.0038)的患者。SOX11mRNA表达在MIPI三组间有统计学意义(P=0.0031),进一步进行多重比较,SOX11mRNA在低危组的表达分别高于中危组和高危组有统计学差异,而中危组与高危组之间无统计学差异。5.2 SOX11mRNA表达与P53基因异常的相关性P53基因野生型组SOX11mRNA表达3.742(2.263,5.717),P53基因异常组3.778(1.386,6.921),两组之间SOX11mRNA表达无统计学差异(P=0.6662)。6.MCL患者SOX11mRNA表达和P53基因异常及MIPI的生存分析:6.1 MCL患者SOX11mRNA表达的生存分析75例MCL患者中位生存时间为33(30-38)月,进一步将患者按照SOX11mRNA水平分为≥平均值(SOX11mRNA≥M)和平均值(SOX11mRNAM)两组,SOX11mRNAM组中位生存时间短于SOX11m RNA≥M组,分别为27个月和50个月,两组间差异有统计学意义(P0.001)。6.2 MCL患者P53基因异常的生存分析P53基因异常组中位生存时间为30个月,野生型组为37个月,差异有统计学意义(P0.05);进一步根据P53基因突变或缺失将患者分为四组:单突变组;单缺失组;同时突变缺失组;突变缺失均阴性组;中位生存分别为30、25、31.5、37个月(P0.05)。生存最好的是双阴性组,同时存在突变和缺失组最差。6.3 MCL患者SOX11mRNA联合P53基因异常的生存分析联合SOX11mRNA水平与P53基因异常,将患者分为4组:P53abeSOX11mRNA≥M;P53abeSOX11m RNAM;P53wtSOX11mRNA≥M;P53wtSOX11mRNAM;生存最好的是P53wt SOX11m RNA≥M组,P53abeSOX11mRNAM组最差。6.4 MCL患者MIPI及联合SOX11mRNA生存分析MIPI低危组中位生存时间44个月,中危组31个月,高危组30月,低危组与高危组之间有统计学差异(p=0.0033),而低危组与中危组、中危组与高危组之间均无统计学差异,但进一步将低危、中危、高危三组按照SOX11m RNA表达分别再分为SOX11mRNAM和SOX11mRNA≥M两组,在低危、中危及高危组三组内,SOX11mRNAM患者的生存时间均短于SOX11mRNA≥M患者(P0.05)。7.荧光定量PCR检测miR-34a和miR-155-5P的表达:MCL中miR-34a表达0.478(0.202,0.821),对照组RHF 0.572(0.265,1.072),二组间无显著性差异(P=0.335)。MCL患者mi R-155-5P表达3.482(2.136,5.048),对照组RHF0.774(0.083,1.834),MCL患者miR-155-5P表达显著高于RHF(P0.001)。8.miR-34a和miR-155-5P表达与临床病理特征的相关性:8.1 miR-34a表达与临床病理特征的相关性ECOG≥2组患者miR-34a表达0.385(0.184,0.69),ECOG2组0.768(0.228,0.976),ECOG≥2组的表达显著低于ECOG2组(P=0.0214);SOX11m RNAM组miR-34a表达0.162(0.107,0.362),SOX11mRNA≥M组0.503(0.219,0.886),SOX11mRNAM组的表达显著低于SOX11mRNA≥M组(P=0.0309)。8.2 miR-155-5P表达与临床病理特征的相关性MIPI低危组miR-155-5P表达3.031(1.27,3.643),中危组4.438(2.99,5.296),高危组4.438(2.704,5.134),三组间有统计学差异(P=0.0432),进一步采用Nemenyi法进行多重比较,低危组表达分别低于高危组和中危组,有统计学差异,而中危组与高危组之间无统计学差异。9.MCL患者miR-34a和miR-155-5P表达的生存分析:9.1 MCL患者miR-34a表达的生存分析根据miR-34a的表达水平将患者分为大于等于平均值(miR-34a≥M)和小于平均值(miR-34aM)两组,前者中位生存时间为39月,后者为28个月,基于log-rank检验结果,两组生存时间的差异有统计学意义(p=0.0049)。9.2 MCL患者miR-155-5p表达的生存分析根据miR-155-5p的表达水平将患者分为大于等于平均值(miR-155-5p≥M)和小于平均值(mi R-155-5pM)两组,前者中位生存时间为31月,后者为36个月,基于log-rank检验结果,两组生存时间的差异有统计学意义(p=0.0281)。10.预后单因素及多因素分析:单因素分析,以α=0.05水准,与较差生存相关的预后因素有病理形态发生母细胞转化、ECOG≥2、P53基因异常、骨髓浸润、MIPI高危组及SOX11m RNAM、miR-34aM和miR-155-5p≥M。多因素分析与预后不良相关的因素为母细胞转化、MIPI高危组及SOX11m RNAM。结论:1.MCL患者SOX11mRNA表达显著高于正常对照;与SOX11mRNAM相比,SOX11mRNA≥M是良好的预后因素,与更长的生存相关,联合MIPI或P53表达情况,可能更好的判断预后。2.虽然多因素分析miR-34aM和miR-155-5p≥M被预后模型剔除,但单因素分析miR-34aM组和miR-155-5p≥M组生存显著差于miR-34a≥M组和miR-155-5pM,提示miR-34a和miR-155-5p表达也有可能与MCL预后相关,更准确的结论依赖于进一步大样本的研究。
【图文】：
2.3 miR-34a 和 miR-155-5P 在 MCL 患者中的表达应用荧光定量PCR检测miR-34a和 miR-155-5P的表达水平，以U6做内参进行扩增（图1A,图1B,图1C）。检测结果采用Shapiro-Willk 正态性检验，miR34与miR155均为非正态分布(其中miR34: W=0.8794, P<0.0001; miR155: W=0.6139, P<0.0001)。因此实验组与对照组关于miR34与miR155的差异性比较均采用Wilcoxon秩和检验。MCL患者miR-34a表达0.478（0.202,0.821），对照组RHF 0.572（0.265,1.072），二组间无显著性差异（P=0.335）。MCL患者miR-155-5P表达3.482（2.136,5.048）, 对照组RHF0.77（0.083,1.834），MCL患者miR-155-5P表达显著高于RHF患者（P＜0.001）（表1）。图 1A U6 扩增图
2.3 miR-34a 和 miR-155-5P 在 MCL 患者中的表达应用荧光定量PCR检测miR-34a和 miR-155-5P的表达水平，以U6做内参进行扩增（图1A,图1B,图1C）。检测结果采用Shapiro-Willk 正态性检验，miR34与miR155均为非正态分布(其中miR34: W=0.8794, P<0.0001; miR155: W=0.6139, P<0.0001)。因此实验组与对照组关于miR34与miR155的差异性比较均采用Wilcoxon秩和检验。MCL患者miR-34a表达0.478（0.202,0.821），对照组RHF 0.572（0.265,1.072），，二组间无显著性差异（P=0.335）。MCL患者miR-155-5P表达3.482（2.136,5.048）, 对照组RHF0.77（0.083,1.834），MCL患者miR-155-5P表达显著高于RHF患者（P＜0.001）（表1）。图 1A U6 扩增图
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.1
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