NbALD1基因和nbe-miR166h-p5在病毒侵染过程中的功能研究

发布时间：2020-03-22 03:07

【摘要】：植物病毒是一类重要的植物病原,对农作物造成严重危害,导致巨大经济损失。病毒在侵染过程中,植物体内的多种抗性途径也会发挥作用,抑制病毒的侵染,减轻病害的严重程度。进一步发掘植物体内参与抗性途径的生物大分子对于了解病毒-植物相互作用、提出新型抗病策略具有重要意义。在前期对马铃薯X病毒(Potato Virus X,PVX)和芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)侵染本氏烟(Nicotiana Benthamiana)小RNA转录组测序数据分析的基础上,发现病毒侵染导致本氏烟AGD2-like defense response protein 1基因(NbALD1)和miR166h-p5(nbe-miR166h-p5)的上调表达,我们对该基因和miRNA在病毒侵染过程中的功能展开了深入研究。ALD1编码一种氨基转移酶,在哌啶酸(pipecolic acid,Pip)合成过程中起重要作用。有研究表明,哌啶酸是植物系统获得抗性的关键因子;ald1突变体植株相比野生型植株更易感染P.s.tomato DC3000;表达ALD1的拟南芥植株对Ps.tomato DC3000抗性增强;同时,表达ALD1的水稻植株对稻瘟病菌的抗病性也增强。但是,ALD1在病毒侵染过程中的功能尚不清楚。本研究中,qRT-PCR证实NbALD1在TuMV侵染植株体内上调表达;利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的沉默系统沉默NbALD1未对植株的正常生长发育造成显著影响;在NbALD1沉默植株上接种TuMV-GFP,发现接种叶上荧光斑点数量显著增加,病毒的积累量也显著增加,并且病毒系统侵染率明显加快;外源施加哌啶酸会提高野生型和NbALD1沉默植株对TuMV的抗病性。沉默NbALD1后分别接种PVX和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),也得到相同的结果,这表明NbALD1沉默有利于TuMV、PVX和TMV的侵染。进一步研究结果表明,NbALD1沉默会降低植株体内水杨酸的含量和水杨酸信号途径下游基因NPR1的表达量;外源施加哌啶酸也会在一定程度上提高转NahG植株对病毒的抗病性,但不能完全恢复抗性,暗示着沉默NbALD1引起的对植株的易感性不仅仅是依赖水杨酸途径下调导致,可能还有其他途径参与其中。进一步研究发现,沉默NbALD1提高了植株体内乙烯前体的含量。而沉默乙烯途径关键基因ACS1、ACO1、EIN2增强了植株对TuMV的抗性;同时,外源施加乙烯前体ACC促进了TuMV的侵染。因此,我们推测NbALD1沉默可能导致乙烯途径的上调提高对TuMV的易感性。这些结果说明NbALD1除了正向调控SA途径参与抗性过程之外,还负向调控乙烯途径参与了抗病毒侵染过程。越来越多的研究表明,miRNA在病毒侵染过程中发挥重要调节作用。我们分析PVX侵染后本氏烟miRNA表达谱变化发现,nbe-MIR166h前体上5'端产生的nbe-miR166h-p5积累量增加,进一步分析发现,nbe-miR1166h-p5的沉默导致植株叶片浓绿;在沉默nbe-miR166h-p5的植株上接种PVX后,PVX侵染所引起的黄化症状明显减弱,叶绿素含量的下降也有一定程度的缓解;并伴随着PVX积累量大量减少。在TuMV和辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mosaic virus,PMMoV)侵染的植株中nbe-miR166h-p5的转录水平也有显著提高。沉默nbe-miR166h-p5后也会减轻TuMV和PMMoV侵染后所引起的黄化症状、叶绿素含量的降低,并且降低了病毒的积累量。同时,我们预测了 nbe-miR166h-p5的三个靶基因,并进行了验证。结果表明nbe-miR166h-p5与PVX等病毒侵染产生的症状相关,并可能参与了植物抗病毒过程。综上所述,本研究揭示了NbALD 通过正向调控SA途径,负向调控乙烯途径参与了植物抗病毒侵染过程;nbe-miR166h-p5通过其表达水平变化参与了植物病毒的症状表现,并可能参与植物抗病毒过程。这些研究对深入了解寄主组分是如何参与抗病的过程有重要的价值。
【图文】：

基因组结构

４３邋科丨５６邋属的邋３１８邋种植物（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ邋ｅｔａｌ．，邋１９８８；邋Ｗａｌｓｈ邋ｅｔａｌ．，邋２００２），严重威胁农逡逑作物的产量和质量，给农业生产带了了巨大的损失。ＴｕＭＶ可由８０多种蚜虫以逡逑非持久性方式传播，其侵染的植株初期表现为叶片褪绿、花叶、皱缩，后期表现逡逑为植株畸形、矮化、生育推迟甚至严重时植株出现死亡等现象。逡逑１．３．２邋ＴｕＭＶ的分子生物学特点逡逑ＴｕＭＶ基因组由一条单组份正义链单链ＲＮＡ分子组成，长约９７９８？９８４４个逡逑核苷酸，编码一个大的开放阅读框（Ｏｐｅｎ邋ｒｅａｄｉｎｇ邋ｆｒａｍｅ，邋ＯＲＦ），这一开放阅读框逡逑被表达成一个多肽前体，，随后在自身编码的蛋白酶（ＰＩ，邋ＨＣ－Ｐｒｏ，邋ＮＩａ－Ｐｒｏ）的参与下逡逑形成１０个结构和功能不同的成熟蛋白Ｐ］、ＨＣ－Ｐｒｏ、Ｐ３、６Ｋ１、ＣＩ、６Ｋ２、ＶＰｇ、逡逑ＮＩａ－Ｐｒｏ、Ｎｉｂ－Ｐｒｏ和ＣＰ蛋白（图１．３）。而Ｃｈｕｎｇ于２００８年发现Ｐ３蛋白编码区内逡逑部存在一个较小的ＯＲＦ，它通过核糖体移码策略翻译形成Ｐ３Ｎ－ＰＩＰＯ蛋白，并且逡逑已经通过免疫印迹杂交证实了邋Ｐ３Ｎ－ＰＩＰＯ确实存在于受侵染的植株中。逡逑▲邋一逦邋＋２邋ｆｒａｍｅ逡逑

预杂交,内固定,滤纸,短时

图２．１邋Ｎｏｒｔｈｅｒｎ邋ｂｌｏｔ转膜不意图逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｄｉａｇｒａｍｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａ邋ｃａｐｉｌｌａｒｙ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ邋ａｐｐａｒａｒｔｕｓ逡逑固定：转膜完成后，用２ｘＳＳＣ溶液漂洗尼龙膜５邋ｍｉｎ，用滤纸吸干水分，纸内固定好，８０°Ｃ高温固定２邋ｈ。固定后可进行预杂交或放于４°Ｃ短时
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.41

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