超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷积累和盐胁迫抗性

发布时间：2020-03-22 08:03

【摘要】：【目的】克隆苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(cytokinin response factor 6),鉴定其在调节花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用,揭示Md CRF6的功能,为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理论依据。【方法】以‘嘎啦’苹果(Malus domestica‘Gala’)为研究材料,利用同源序列比对和PCR技术,分离细胞分裂素响应基因Md CRF6。使用MEGA 5.0软件构建苹果Md CRF6与拟南芥CRFs间系统进化树;通过SMART软件和DNAMAN软件分析Md CRF6蛋白的保守结构域。利用实时荧光定量PCR方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁迫的响应。通过电泳迁移率试验(EMSA),验证Md CRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定。构建Md CRF6植物超表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得转Md CRF6苹果愈伤组织。比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青苷积累和盐抗性方面的差异,结合基因表达分析,初步鉴定Md CRF6在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能。【结果】分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因Md CRF6(基因序列号:MDP0000783818),该基因开放阅读框(ORF)为1 047 bp,编码含有348个氨基酸的蛋白。进化树分析和氨基酸序列比对结果表明,苹果Md CRF6蛋白在N端包含保守的CRF结构域,在C端包含保守的AP2/ERF结构域,并且与拟南芥At CRF6同源性最高。基因表达分析显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应,分别在10μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 Na Cl处理3 h和6 h时表达量最高。EMSA试验结果验证Md CRF6原核表达蛋白能够绑定DRE序列。在苹果愈伤组织中超表达Md CRF6,发现Md CRF6转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制,同时苹果愈伤组织的抗盐性降低。基因表达分析显示,Md CRF6显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达。【结论】苹果Md CRF6与拟南芥At CRF6具有高度的同源性,其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应。在苹果愈伤组织中超量表达Md CRF6抑制其花青苷积累,降低植物抗盐性。推测苹果Md CRF6可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子,抑制基因的表达,从而负调节花青苷积累和抗盐性。
【图文】：

苷含量。计算公式：OD=（A530-A620）-0.1×(A650-A620)。1.7苹果愈伤组织盐胁迫试验选择生长状态一致的野生型（WT）和转基因（MdCRF6-L1和MdCRF6-L2）苹果愈伤组织进行盐胁迫试验。将大小一致的愈伤放置到含有不同NaCl浓度的继代培养基上。常温、暗处培养15d，观察并称量愈伤组织的质量。1.8统计学分析使用R（3.0.2）软件进行统计学分析。所有结果都是基于3个平行试验的平均值。2结果2.1苹果MdCRF6的克隆及同源性分析以‘嘎啦’幼苗的cDNA为模板，MdCRF6-F/R为引物进行PCR扩增，获得一条大约1000bp的条带（图1）。对克隆得到的片段测序分析，结果表明，，该基因片段的开放阅读框（ORF）长度为1047bp，编码含有348个氨基酸的蛋白质，命名为MdCRF6（MDP0000783818）。图1苹果MdCRF6的RT-PCR扩增产物电泳Fig.1ElectrophoresisofRT-PCRproductsforMdCRF6cloning将苹果MdCRF6氨基酸序列与拟南芥中12个细胞分裂素响应因子基因（AtCRF1—AtARF12）的氨基酸序列进行比对并构建进化树（图2）。进化树分析结果表明，苹果MdCRF6与拟南芥AtCRF6亲缘关系最近，同源性最高。AtCRF6AT3G61630.1MdCRF6MDP0000783818AtCRF11AT3G25890.1AtCRF3AT5G53290.1AtCRF10AT1G68550.1AtCRF3AT4G23750.1AtCRF4AT4G27950.1AtCRF1AT4G11140.1AtCRF9AT1G49120.1AtCRF5AT2G46310.1AtCRF12AT1G25470.1AtCRF1AT1G22985.10.05AtCRF1AT1G71130.1At：拟南芥Arabidopsisthaliana；Md：苹果Malusdomestica图2苹果MdCRF6与拟南芥CRFs的进化树分析Fig.2PhylogenetictreeanalysisofMdCRF6withCRFsfromArabidopsis对苹果MdCRF6的氨基酸序列进行分析（图3）。结果显示，MdCRF6仅包含一个外显子，无内含子。MdCRF6蛋白在N端包含一个保守的CRF结

薈CGAC）序列突变为-CCGGAG-，结合条带消失（图5）。2.4载体构建与转基因苹果愈伤组织鉴定构建MdCRF6超表达载体MdCRF6-pCAMBIA1300（图6），转化农杆菌LBA4404，通过农杆菌介导的遗传转化侵染苹果愈伤组织。实时荧光定量PCR检测转基因株系MdCRF6表达量（图7）。获得L1和L2两个转基因株系。ARR6启动子序列pARR6:-GCAAGATTTAACCGACCCAAACCGAT-ARR6启动子突变序列pARR6(Mut):-GCAAGATTTACCGGAGCCAAACCGAT-5×10×Mut自由探针Free-Probe结合探针Bound-ProbeCompetitorBiotin-ProbeGST-MdCRF6GST图5MdCRF6绑定DRE序列Fig.5MdCRF6bindstoDREmotif

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