哈萨克族食管鳞癌差异突变基因Thsd7a的功能和调控机制研究

发布时间：2020-03-22 13:36

【摘要】：目的:本课题依托团队前期哈萨克族和维吾尔族食管鳞癌患者外显子测序结果,分析凝血酶敏感蛋白1型7a(Thsd7a)基因在新疆四个民族食管鳞癌的表达差异,阐述哈萨克族食管鳞癌组织中Thsd7a表达水平与食管癌临床恶性表型、预后的关系。进一步探究Thsd7a对于食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响及在食管鳞癌中发挥作用的通路;在基因芯片发现的Thsd7a疑似下游基因基础上,通过下游驱动基因筛选及体内外功能试验,明确Thsd7a下游新驱动基因,分析食管鳞癌组织中Thsd7a下游驱动基因的临床意义,探究下游基因在肿瘤发生发展过程中的生物学功能,为食管癌的个体化靶向治疗和进一步临床应用等研究奠定基础。方法:(1)按照2009年第七版的食管癌TNM分期标准,分别入选四个民族的食管癌患者并收集组织标本。通过石蜡包埋组织免疫组织化学方法检测Thsd7a在癌和癌旁组织的表达情况。针对表达有显著差异的民族(哈萨克族),进一步通过RT-PCR检测目的基因在mRNA水平的表达情况,明确Thsd7a是否存在民族差异以及表达的特点;(2)在明确Thsd7a在哈萨克族食管癌组织中表达显著的情况下,分析Thsd7a的表达变化与哈萨克族食管鳞癌病理分期、浸润深度等临床病理指标的相关性,以及与患者预后的关联性;(3)在临床样本的基础上,通过构建Thsd7a的干扰质粒载体和慢病毒载体从体外细胞水平,检测Thsd7a对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等细胞功能的影响;(4)在体外细胞学实验基础上,通过构建裸鼠移植瘤体模型,观察瘤体生长情况等,进一步明确Thsd7a基因对细胞生长的影响;(5)对Eca 109细胞敲减Thsd7a基因后,采用高通量基因芯片筛查和验证Thsd7a功能相关关键信号通路;(6)在基因芯片发现的疑似下游食管癌相关基因基础上,细胞水平采用RT-PCR确认疑似基因与Thsd7a的上下游关系;(7)在目的基因3个干扰靶序列预混后,采用Celigo实时监测细胞生长,统计分析出最显著影响细胞生长的下游驱动基因;(8)再次采用Celigo进行显著差异基因的单靶点验证;(9)针对单靶点验证的阳性基因,进一步采用细胞功能学实验(MTT、克隆形成实验、细胞周期、细胞凋亡、划痕实验、transwell迁移实验、Western blot)验证目的基因功能;(10)通过3个食管鳞癌细胞目的基因外显子测序,探索基因功能的根源。结果:第一部分:(1)免疫组织化学检测Thsd7a在各民族正常食管和ESCC组织中的蛋白表达情况:100例维吾尔族、100例汉族和11例蒙古族ESCC组织中Thsd7a蛋白阳性表达率分别为35.0%、28.0%和27.3%,87例维吾尔族、94例汉族和9例蒙古族癌旁正常对照组织中Thsd7a阳性表达率分别为29.9%、19.2%和33.3%。维吾尔族、汉族和蒙古族正常食管组织Thsd7a蛋白阳性率与ESCC组织差异不显著。而哈萨克族癌旁正常对照组织Thsd7a蛋白阳性率明显低于ESCC组织;(2)免疫组化和RT-PCR实验均显示哈萨克族食管鳞癌患者的癌组织中Thsd7a的表达量显著高于癌旁正常组织,且差异有统计学意义;(3)Thsd7a的表达与临床分期(P=0.04)和分化程度(P0.01)具有显著相关性。即临床期别越晚,肿瘤分化程度较高的情况下,Thsd7a的表达率越高;(4)Thsd7a的表达量与预后没有显著相关性,但临床分期、T分期和N分期以及分化程度与哈萨克族食管鳞癌患者的预后相关。COX多因素分析显示临床分期和T/N分期,是预后的独立危险因素。第二部分:(1)敲减Thsd7a后,MTT实验显示EC 9706和Eca 109的增殖活性均显著受到了抑制;细胞划痕和transwell迁移实验显示,EC 9706和Eca 109细胞的迁移能力受到了显著的抑制;侵袭实验显示,EC 9706和Eca 109细胞株的侵袭能力在敲减Thsd7a后受到了显著的抑制,说明了目的基因能够分泌金属蛋白酶,具有较强侵袭能力;流式细胞术检测发现,敲减Thsd7a能够使得细胞周期阻滞在G0/G1期,且细胞凋亡率明显增加;(2)裸鼠成瘤实验显示,敲减Thsd7a能够有效的抑制Eca 109细胞在裸鼠体内的成瘤能力;(3)采用微阵列基因芯片检测Thsd7a敲减后Eca 109细胞中mRNA表达水平发生显著差异的基因和信号通路。进一步RT-PCR验证后,发现Thsd7a与五个经典通路显著相关,分别为:mTOR通路、Cell Cycle G1/S Checkpoint通路、Wnt通路、AMPK通路和ERK/MAPK通路。第三部分:(1)采用生物信息学的方法分析基因芯片对应的实验结果:首先在PUBMED进行基因已发表文章的筛选,入选标准为报道数量少于100篇,在肿瘤中研究比较少,且在食管癌中没有报道过的基因。通过以上的筛选条件,挑选出37个候选基因;(2)将anti-Thsd7a shRNA转染到Eca 109细胞实现Thsd7a基因的稳定敲减,从而观察体外细胞水平Thsd7a显著相关的下游基因。结果发现,其中11个基因下调显著(40%),因此对这11个基因进行功能学筛选。(3)对目的基因逐一设计3个干扰靶点进行混合,并转染到Eca 109细胞。通过Celigo仪高通量实时检测的方法,结果发现2个基因(SCARA5和SMCO4)能够显著影响食管鳞癌细胞增殖能力。并进一步通过单靶点Celigo验证的方法,证实并明确了敲减效率显著的干扰序列shSCARA5(PSC38272)和shSMCO4(PSC37528)。(4)SCARA5在食管癌细胞系的本底表达检测显示,SCARA5在Eca 109和EC 9706细胞中表现为高表达,在TE-1细胞中表现为低表达。(5)敲减SCARA5后,MTT实验显示体外食管癌细胞系Eca 109的增殖活性受到了显著抑制;细胞克隆形成实验显示,Eca 109的细胞克隆形成能力受到显著抑制;细胞划痕和transwell迁移实验显示,Eca 109细胞的迁移能力受到了显著的抑制;流式细胞术检测发现,敲减SCARA5能够使得细胞周期阻滞在S期和G2/M期,且细胞凋亡率明显增加。(6)外显子测序结果显示,SCARA5表现为促癌功能可能是因为该基因5号外显子的第30位基因序列出现CT错义突变(C/G)引起的。结论:(1)免疫组化实验检测Thsd7a在维吾尔族、哈萨克族、汉族和蒙古族食管鳞癌和癌旁组织的表达情况。结果显示,Thsd7a在维吾尔族、汉族和蒙古族的食管癌患者癌和癌旁表达差异不显著,而在哈萨克族食管鳞癌和癌旁正常组织表达差异显著;(2)Thsd7a在哈萨克族食管鳞癌组织中表达显著,且Thsd7a表达与食管癌患者分化程度、临床分期显著相关;(3)Thsd7a能抑制食管鳞癌细胞的凋亡,影响细胞周期,促进癌细胞的增殖、迁移。在裸鼠移植瘤实验中,Thsd7a在体内能够促进食管癌细胞生长,发挥着癌基因的作用;(4)Thsd7a发挥功能需要通过5个经典肿瘤相关通路来完成。而且Thsd7a下游驱动基因SCARA5,在食管癌细胞中同样发挥促癌的功能;(5)通过食管癌细胞的外显子测序发现,抑癌基因SCARA5在食管癌细胞系中表现促癌功能,可能主要源于外显子突变特别是5号外显子的CT错义突变。本研究为食管癌的靶向治疗提供了新的靶点和思路。
【图文】：

第一部分·结 果达情况白在正常食管粘膜上皮散在分布，定位于细胞膜呈黄色阳性细胞多呈巢形或灶形分布（见图1-1）。100例维吾尔古族ESCC组织中Thsd7a蛋白阳性表达率分别为35.0%（3527.3%（3/11），87例维吾尔族、94例汉族和9例蒙古族癌性表达率分别为29.9%（26/87）、19.2%（18/94）和33.3%和蒙古族正常食管组织Thsd7a蛋白阳性率与ESCC组织相似.05，，表1)。117例哈萨克族ESCC组织中Thsd7a蛋白阳性表111例正常食管组织中Thsd7a阳性表达率为18.0%（20/111照组织Thsd7a蛋白阳性率明显低于ESCC组织,差异有1-3)。组织化学检测Thsd7a在各民族正常食管和ESC

G：食管鳞癌组织（×200） H：食管鳞癌组织（×400）G：ESCC tissues（×200） H：ESCC tissues（×400）图1-2 Thsd7a在哈萨克族食管鳞癌及癌旁正常食管组织中的表达Fig. 1-2 The expression of Thsd7a in Kazakh’s ESCC and adjacent normal tissuesa
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.1


本文编号：2595114