人牙髓细胞—富血小板纤维蛋白（hDPCs-PRF）复合体hDPCs成牙本质细胞标志基因的表达

发布时间：2020-03-27 00:36

【摘要】：目的:通过体外分析hDPCs-PRF复合体的三维结构及hDPCs-PRF复合体中hDPCs的迁移及成牙本质向分化的能力,探索h DPCs-PRF复合体中hDPCs的生物学行为,评估hDPCs-PRF复合体作为牙髓组织再生支架的可行性。方法:1实验一:采用组织块法分离培养hDPCs,免疫组织化学染色法检测波形丝蛋白、角蛋白的表达。Choukroun一步离心法制备PRF,于离心前迅速加入0.5ml,1×10~5个/ml hDPCs重悬液,之后离心完成hDPCs-PRF复合体的制作。将复合体分离出来后放入10%培养液中培养,每3天更换一次液,并于培养的第7天、14天、21天行HE,免疫组织化学观察及扫描电镜观察;2实验二:h DPCs-PRF复合体的制备同实验一。PRF的制备:采集5ml血后加入0.5ml的PBS进行2700rpm/min,离心12min。将离心后的复合体及PRF弃去下层红细胞,只保留白膜层以上10cm作为研究对象。实验分为三组,hDPCs-PRF复合体组,PRF+细胞组及单纯细胞培养组。hDPCs-PRF复合体组的人牙髓细胞嵌入在PRF的白膜层中生长增殖,PRF+细胞组的人牙髓细胞游离于PRF外,单纯细胞培养组人牙髓细胞单独培养。以上三组在加入有4ml 10%矿化液的六孔板中培养,每三天换一次液。于7d,14d收集样本行RT-PCR检测人牙髓细胞ALP、DSPP、COL-I mRNA的表达水平。结果:1经组织块法培养的牙髓细胞,形态单一,呈长梭形。免疫组化染色显示波形丝蛋白呈阳性,角蛋白呈阴性,提示该细胞为间充质来源。2 h DPCs-PRF复合体宏观上与PRF相似,主要由黄色纤维蛋白和末端红细胞构成,中间为富含白细胞的白膜层。SEM可观察到复合体中的处于皱缩状态的hDPCs以及各种白细胞,红细胞。显微镜下观察,hDPCs-PRF复合体是由柔软、致密聚合的纤维蛋白链组成的三维结构。红色部分主要是正常形状的红细胞夹带一些未成熟的纤维蛋白;中间的白膜层中可以看到密集核蓝染的白细胞及血小板,形状不规则且体积比白细胞大的细胞;波形蛋白及角蛋白染色结果显示体积较大的细胞波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,提示为制备复合体时加入的hDPCs。培养的第7d、14d、21天观察发现随着培养时间的推移,白膜层逐渐地溶解消失,白细胞及hDPCs随白膜层的消失,逐渐消失或沿着复合体边缘游走。3 RT-PCR结果显示在矿化诱导第7天,复合体组中ALP及COL-I、mRNA表达都比对照组和(PRF+细胞)组高;第14天复合体组中时DSPP及COL-I mRNA表达都比对照组高,差异均具有统计学意义。结论:1将人牙髓细胞嵌入PRF中制备成hDPCs-PRF复合体,复合体可缓慢释放复合体内的牙髓细胞到培养基中。2 hDPCs-PRF复合体为其内的人牙髓细胞提供良好的生长和分化的环境,在矿化诱导的培养条件下,复合体内的人牙髓细胞成骨/牙本质标记基因的表达增强,提示hDPCs-PRF复合体更有利于促进牙髓组织的再生。
【图文】：

放射状,梭形,免疫组化染色,纤维蛋白

图 1-1 hDPCs 的培养与鉴定染色Figure1-1 culture and identify of hDPCsA :接种后 7 天组织块周围有梭形或多角形细胞爬出，呈放射状（×40 倍）B :第三代 hDPCs 形态均一，呈长梭形，平行排列或呈漩涡状生长（×40 倍）C :hDPCs 角蛋白免疫组化染色阴性（×100 倍）D :hDPCs 波形蛋白免疫组化染色阳性（×100 倍）3.2 hDPCs-PRF 复合体3.2.1 大体观察结果离心后的血液分为 3 层，上层为少量贫血小板血浆（platelet-poor-plasma,ppp)（图 1-2A1），中间层为复合体(图 1-2A2)，下层为红细胞(图 1-2A3)。分离出的复合体肉眼观可以分为三部分，上面为黄色的纤维蛋白基质（fibrin matrix)（图 1-2 B4）以及下端的红细胞（RBC）（图1-2 B6），在这两个部分之间有一层白色区域为白膜层（buffy coat）（图 1-2

分布图,贫血小板血浆,红细胞,凝胶

图 1-2 hDPCs-PRF 复合体Figure 1-2 hDPCs-PRF complexA :1 为贫血小板血浆（ppp），2 为 PRF 凝胶，3 为红细胞B :PRF 凝胶由以下组成：4 为纤维蛋白基质，5 为白膜层，6 为红细胞3.2.2 hDPCs-PRF 复合体扫描电镜观察扫描电镜观察结果SEM 显示凝块纤维蛋白呈条索状，广泛的聚集和凝结而形成的簇，聚集形成了坚实而厚实的网状结构。部分呈团状，这是由致的纤维收缩。牙髓细胞皱缩成不规则圆形，镶嵌在纤维网络中维蛋白链分布图 1-7 示 4。红细胞形状正常，，呈双凹圆盘状；白细球形结构，不规则表面。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R781

【参考文献】