欧李CCDs基因的克隆与功能分析

发布时间：2020-04-01 18:40

【摘要】：欧李是我国特有的灌木果树,果实色泽鲜艳,风味独特,香气浓郁,营养丰富。研究其色泽与风味的代谢具有重要意义。CCDs基因可以在类胡萝卜素的不同位点发生催化裂解,生成多种脱辅基类胡萝卜素,脱辅基类胡萝卜素具有多种生物学功能,如CCD1和CCD4主要调控植物果实的色泽和风味,CCD7和CCD8参与了独金角素的合成,NCED是脱落酸合成步骤中主要的限速酶。本研究以欧李品种'农大4号'为材料,从中克隆到ChCCD1基因和ChCCD4基因,构建了原核表达载体,导入合成类胡萝卜素的工程菌中,通过观察菌液颜色的变化和GC-MS检测裂解产物,分析了 ChCCDs基因功能。旨在为某些色泽与风味相关基因的功能研究提供思路和方法,为欧李育种奠定基础。主要研究结果如下(1)对欧李转录组数据分析,利用RT-PCR克隆方法获得了欧李的两个ChCCDs基因的CDS序列,分别为ChCCD1和ChCCD4。其中ChCCD1基因CDS序列长度为1644bp,编码547个氨基酸;ChCCD4基因CDS长度为1794bp,编码597个氨基酸,生物信息分析发现两个ChCCDs基因都属于CCDs基因家族,ChCCD1和ChCCD4基因编码的蛋白都含有RPE65保守结构域。系统进化树分析发现,欧李CCDs蛋白与梅,桃和梨等果树的CCDs蛋白亲缘关系较近。(2)以欧李品种'农大4号','农大5号','农大6号'和'农大7号'不同成熟期果实为实验材料,提取每个品种果实不同时期的总RNA,反转录成cDNA,通过荧光定量PCR分析CCDs基因在四个欧李品种果实不同成熟其的表达量。结果表明:ChCCD1在四个品种中总体表达量在幼果期较高,成熟期较低;ChCCD4在'农大4号'幼果期表达量较高,成熟期较低,在其他三个品种中,幼果期表达量相对较低,成熟期相对较高(3)将ChCCDs基因连接到原核表达载pet-28a上,构建原核表达载体pet-ChCCD1和pet-ChCCD4。将两个原核表达载体分别导入能够合成类胡萝卜素的工程菌中,结果发现ChCCD1能够降解番茄红素β-胡萝卜素和玉米黄素,ChCCD4也能降解番茄红素和β-胡萝卜素,但没有ChCCD1显著,ChCCD4几乎不降解玉米黄素。GC-MS分析ChCCDs基因的裂解产物,发现ChCCD1裂解番茄红素生成了 6-甲基-5庚烯-2酮,裂解β-胡萝卜素生成了 β-紫罗兰酮。
【图文】：

Ｆｉｇ邋１－２邋ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｆｏｒ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ逡逑欧文氏阐的１ｌ个合成＋邋１４类胡萝卜者的堪因质粒载体，分别足ｐＡＣＣＲＴ－Ｅ．，邋ｐＡＣＣＲＴ－ＥＢ，逡逑ｐＡＣＣＲＴ－ＥＢｌ，邋ｐＡＣＣＡＲ１６ＡｃｒｔＸ邋和邋ｐＡＣＣＡＲ２５ＡｃｒｔＸ邋（闯邋１－２，图片摘自文献州）这／ｌ逡逑个质粒载体分别能合成栊卞儿基垅１邋？？儿基焦磷酸，八氢番茄红素，番茄红素，Ｐ－胡萝卜逡逑＊

以欧李果实ＲＮＡ反转录合成的ｃＤＮＡ为模板，根据欧李转录组数据找到的逡逑基因的ＣＤＳ序列设计引物，ＰＣＲ扩增得到了邋ＣＣＤ／和ＣＣＺＷ基因，命名为ＣＴｚＣＣＤ／和逡逑０＾０）４。与转录组数据中的基因序列大小相同，，分别１６４物？和１７９朴？，如图２－２，左逡逑图为Ｃ７ＣＣＤ／右图为0７ＣＯ＾。将ＣＣＤｓ基因连接到克隆载体，导入大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ，逡逑ＰＣＲ扩增的目的列测序结果与转录组测序一致。逡逑Ｍ邋１逦２逦１逦２邋Ｍ逡逑＾逦购逡逑ｉ５00ｂｐ逦１000咏逡逑７５０ｂｐ逦７Ｓ0ｂｐ逡逑５００ｂｐ逦５００邋ｂｐ逡逑ｘｏｏｂｐ逦ＢＢＨＢａ邋２５0ｂｐ逡逑ｉ00ｂｐ逡逑图２－２邋Ｃ／？ＣＣＤｓ基因ＰＣＲ凝胶电泳图逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＣｈＣＣＤｓ逡逑２０逡逑
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S662.5

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本文编号：2610818