花鲈Toll通路关键因子TRAF6和IRAK4基因在细菌刺激下的表达分析与功能研究

发布时间：2020-04-03 19:12

【摘要】：花鲈(Lateolabrax maculatus)为广盐性海水鱼,易养殖,经济效益高,是我国重要的经济鱼类。但随着养殖方式的改进,养殖密度的增加的同时,花鲈病害问题也频繁发生。因此,通过研究花鲈的抗病免疫机制,探寻增强花鲈抗菌能力的途径和方法,为养殖中的病害诊治提供理论支持愈加重要。先天免疫系统是普遍存在于各类机体中的重要防御机制,其主要通过免疫细胞表面的模式识别受体识别病原生物表面的病原体相关分子模式来启动。作为模式识别受体的重要成员,Toll样受体可识别多种病原生物,并能连接先天性免疫和特异性免疫系统。TRAF6和IRAK4是Toll样受体家族信号通路中的重要接头分子,它们通过与MyD88和IRAK1等形成复合物将免疫信号传递到下游NF-κB,引起系列促炎细胞因子的表达,引起机体免疫反应。基于Toll信号通路对细菌的识别功能,以及TRAF6和IRAK4在Toll样通路的信号传递作用,本研究克隆了L.maculates的LmTRAF6和LmIRAK4基因序列,并分析了其序列特征、亚细胞定位、各组织含量以及菌应激下的表达模式。为进一步探索LmTRAF6参与抵抗细菌侵害的作用及方式,本研究检测了过表达LmTRAF6的HEK293T细胞在菌刺激下的凋亡率,以及此时细胞内NF-κB活性的变化。此外,本研究利用花鲈头肾原代培养细胞开展了LmTRAF6过表达实验及siRNA干扰实验,初步建立了以花鲈细胞为载体的基因研究平台,为深入研究花鲈基因结构功能、表达规律及其上下游因子提供了基础。LmTRAF6基因cDNA ORF全长1707 bp,编码568个氨基酸,理论分子量约64.01 kDa,理论等电点是6.01。结构域分析表明,LmTRAF6氨基酸序列含有1个N端环指结构(80~119 aa)、2个锌指结构域(161~202 aa,214~268 aa)、1个环-环α螺旋结构(355~395 aa)和C端的TRAF同源结构域(394~541 aa)。其不含跨膜结构域和信号肽。多重序列比对结果表明LmTRAF6与其他物种LmTRAF6序列高度保守,与条石鲷TRAF6相似度最高(93%)。亚细胞定位结果表明其主要分布于HEK293T细胞的细胞质中。各组织定量分析表明LmTRAF6在多个组织中均有表达,在鳃中表达量最高,其次是脑、肠和脾脏。体内菌刺激实验结果表明,经Vibrio harveyi和Streptococcus agalactiae应激后,LmTRAF6在脾脏、头肾和肝脏中表达显著升高,说明LmTRAF6与花鲈的抗菌机制有关,参与了机体的免疫反应。为了进一步证明LmTRAF6可参与抗菌免疫反应,基于HEK293T免疫模型,检测了过表达LmTRAF6的HEK293T细胞分别在V.harveyi和S.agalactiae刺激下的凋亡率。结果显示,在两种菌刺激下,转染LmTRAF6的细胞系活细胞数量较对照组分别提高了18.85%和5.4%。说明LmTRAF6可在一定程度上提高细胞抵抗菌刺激的免疫能力。为了验证LmTRAF6可通过激活NF-κB增强细胞抵抗V.harveyi和S.agalactiae的免疫能力,本研究采用双荧光素报告系统检测了LmTRAF6对HEK293T内NF-κB的激活效果。结果表明:HEK293T在转染LmTRAF6后NF-κB活性显著升高;当HEK293T在面对V.harveyi和S.agalactiae刺激时,转染LmTRAF6可进一步提高NF-κB活性,且细胞存活率升高。说明LmTRAF6可能是通过激活NF-κB来调控免疫因子的表达,以参与到细胞抵抗细菌的免疫过程中。功能域是蛋白质行使功能的主要部位,为了研究LmTRAF6活化NF-κB的主要依赖功能域,本研究采用双荧光素报告系统检测了功能域缺失的LmTRAF6对NF-κB的激活效果。结果表明:缺少环指结构域或锌指结构域,会抑制LmTRAF6对NF-κB的激活作用;而缺失MATH结构域则对LmTRAF6活化NF-κB没有明显的影响。说明环指结构域或锌指结构域是LmTRAF6向下传递信号的关键功能域。LmIRAK4基因cDNA ORF全长942bp,编码313个氨基酸,理论分子量约34.97kDa,理论等电点是5.65。结构域分析表明,LmIRAK4含有1个N端死亡结构域(8~104 aa)和1个中央蛋白激酶结构域(185~312 aa)。推导的LmIRAK4氨基酸序列与其他鱼类IRAK4氨基酸序列具有高度一致性,与条石鲷IRAK4相似度最高(84%)。亚细胞定位显示,LmIRAK4在HEK-293T细胞成功表达,且主要分布于胞质中。组织分布结果表明LmIRAK4在各组织中表达具差异性,在头肾中表达量最高,其次为鳃和肝脏。感染无乳链球菌与哈维弧菌后,花鲈头肾、肝脏和脾中LmIRAK4 mRNA的表达水平显著升高,说明LmIRAK4参与了花鲈的免疫反应。为了建立以花鲈细胞为载体的基因研究平台,本研究培养了花鲈头肾原代细胞,并进行了LmTRAF6过表达及干扰实验。结果表明:外源性LmTRAF6表达成功,但表达量较少,需进一步探索启动子等相关因素;内源性LmTRAF6被siRNA成功干扰,表达量下降至30%。该实验为深入研究花鲈基因结构功能、表达规律及其上下游因子提供了初步的基础平台。
【图文】：

信号通路,负调控因子,鱼类,因子

图 1-1 鱼类 TLRs 信号通路Fig 1-1 The signaling pathway of fish TLRs白色部分表示正调控因子；灰色部分表示负调控因子。The white means positive regulatory factors; Negative regulatory factors are highlighted with grey. 信号通路的关键因子 TRAF6 及 IRAK4AF6 结构与功能所述，TRAF6 是 TLR 信号通路内的重要接头蛋白，其所在的家子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor-associated factorsAFs 家族成员分布广泛，，是一类多功能蛋白。它们作为胞内接头疫受体家族的信号传导，它们不但能够在 IL-1/TLR 家族信号通能直接与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族结、DR3、TRAIL-R2、CD40、Ox40 和 TACI 等 29 种 TNF 成员[62

氨基酸序列,核酸,氨基酸序列,死亡结构域

24图 2-4 LmIRAK4 的核酸和氨基酸序列Fig. 2-4 The nucleotide and deduced amino acid sequences of LmIRAK4.两边每行标注的序号指核苷酸和氨基酸的位置：起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA）用方框标出；单下划线标注为 N端死亡结构域序列；双下划线标注为中央蛋白激酶结构域序列。The initiation code (ATG) and the termination code (TGA) are boxed. The N-terminal death domain is underlined, and C-terminalprotein kinases domain site is double underlined.
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943

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