基因编辑BmNPV iap2和orf59的家蚕抗性素材创制

发布时间：2020-04-06 06:10

【摘要】：家蚕作为具有重要经济价值的鳞翅目昆虫,每年受蚕病危害十分严重,严重制约了我国蚕丝产业的可持续发展。其中家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)所造成的家蚕血液型脓病是最常见的且危害最大的蚕病之一。由于传统抗性育种的周期过长,加之抗性多与经济性状成负相关,因此,迫切需要通过分子育种来提高家蚕的抗病性。本研究首先在细胞水平敲除BmNPV凋亡抑制因子iap2和增殖复制相关基因orf59,检测其对BmNPV增殖复制的影响;其次通过转基因技术构建了共同敲除BmNPV iap2和orf59基因的转基因家蚕,对构建的转基因家蚕的基因编辑效率和脱靶效率进行了系统的检测;进而检测了转基因家蚕对BmNPV的抗性效果,以及对BmNPV的DNA复制和基因转录影响,并鉴定转基因家蚕对个体生长发育和经济性状的影响;最后通过转录组数据初步分析转基因家蚕品系调控细胞凋亡,进而抑制BmNPV增殖复制的作用机制。论文取得的主要结果如下:1.BmNPV iap2和orf59对BmNPV增殖的影响利用CRISPR/Cas9系统构建了单独敲除BmNPV iap2和orf59的表达载体。相对定量检测病毒不同时期基因的转录水平变化,发现敲除BmNPV iap2和orf59,病毒基因的表达量在48h都有了明显的下调。进一步同时敲除BmNPV iap2和orf59,荧光定量分析显示病毒基因转录水平进一步下调,同时对敲除BmNPV iap2之后对宿主凋亡相关基因进行检测,发现caspase家族基因BmICE的表达量有明显上调,而Bcl-2家族基因BmBuffy的表达与对照相比没有明显变化。以上结果表明,可以通过敲除BmNPV抗凋亡基因iap2和复制相关基因orf59引起家蚕细胞凋亡通路变化,从而抑制BmNPV增殖复制,应用于家蚕抗病育种研究。2.基因编辑BmNPV iap2和orf59的抗性素材创制为了进一步分析应用抗凋亡作用提高家蚕抗病毒作用的效率,本研究成功的构建了转基因注射载体piggyBac[U6-sgIAP2-U6-sgORF59-3×P3 DsRed afm],通过显微注射技术获得表达sgIAP2sgORF59的转基因家蚕,与表达Cas9蛋白的转基因家蚕杂交之后获得获得双阳性品系Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+)和对照品系Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(-)、Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(+)和Cas9(-)/sgIAP2sg ORF59(-)。通过T7E1酶切和T克隆测序检测发现双阳性品系在添食BmNPV 12h起就能够有效的编辑靶位点,48h编辑效率达到100%,并持续到120h。靶基因的编辑频率进行统计结果表明,从添食病毒12h开始出现比例较小的大片段缺失,仅有19.4%,到120h大片段缺失的比例达到62.5%。对2个靶位点预测的6个脱靶率最高的脱靶位点经T克隆测序分析未检测到脱靶现象。以上研究表明我们获得了能够特异性的编辑BmNPV基因组的转基因基因编辑家蚕。3.转基因家蚕的抗性鉴定和主要经济性状分析通过对双阳性品系和对照品系在4龄起蚕添食不同剂量的BmNPV,鉴定这两个家蚕品系对BmNPV的抗性水平。结果显示,Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+在添食不同剂量的ODV之后相比于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)的发病时间均推迟1~2天,且最终的死亡率均高于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)。SPSS软件进一步分析Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+)家蚕的LD_(50)为2.25×10~6多角体/头,相比对照品系Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)的LD_(50)为2.46×10~4多角体/头,其抗性提高了近100倍。通过荧光定量PCR检测病毒DNA的拷贝数,结果显示转基因家蚕在4龄起的添毒实验中,病毒DNA的拷贝数从72h起明显低于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-),在5龄起添食BmNPV后,从96h开始双阳性品系的DNA拷贝数受到了明显的抑制。qRT-PCR检测结果显示双阳性品系的病毒基因ie-1、gp64、vp39、poly在4龄起蚕添食BmNPV后的转录水平从48h起显著低于对照品系,5龄起蚕添食病毒后病毒基因的转录水平则从96h起开始明显低于对照品系。为了分析转基因品系个体发育和经济性状是否受到了影响,本研究对获得的4种杂交品系的幼虫体重和全茧量、茧层量和茧层率进行称重统计分析,结果显示均没有明显变化。以上结果表明,本实验所构建的转基因家蚕不仅可以提高对BmNPV的抗性,而且对其经济性状没有影响。4.转基因家蚕的抗性差异基因分析为了探究转基因家蚕凋亡调控的抗性机制,本研究对Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+)和Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)品系添食BmNPV 48h后的样品进行了转录组分析。首先本研究对提取的样品进行病毒基因复制水平检测,结果显示,在添食BmNPV 48h后,Cas9(+)/sgIAP2sgORF59(+)品系的vp39表达量显著低于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-)品系。转录组分析结果显示,共筛选到709个差异基因,其中上调基因有194个,下调基因有515个。对差异基因进行eggNOG聚类分析,结果显示,差异基因主要集中在能量转运、核糖体翻译、翻译与修饰这三类功能中。通过KEGG通路聚类分析差异基因,结果显示差异基因主要集中在氧化磷酸化通路,共有41个差异基因,且全部为下调表达基因。从这41个差异基因中筛选出12个差异较大的基因进行荧光定量检测,结果表明其在感染BmNPV 48h后转基因家蚕的转录水平的确低于Cas9(-)/sgIAP2sgORF59(-),且在细胞水平的检测结果与转录组数据一致。为了鉴定敲除BmNPV iap2基因之后对家蚕细胞凋亡的影响,本研究检测了凋亡相关基因Bmiap2、BmICE、BmBuffy的转录水平变化,结果发现Bmiap2的表达下调,BmICE的转录水平有明显上调,而BmBuffy表达没有明显变化。说明在敲除BmNPV iap2和orf59之后,主要引起宿主能量水平和凋亡相关通路的变化。
【图文】：

模型图,杆状病毒,宿主细胞,互作

西南大学硕士学位论文作，可以调节 caspase 之间的相互作用和酶的失活，，以及与一些解离 IAP-casp合物因子间的相互作用；并且在突变 BmNPV 的 iap2 基因后，病毒的增殖复受到了明显的抑制。虽然病毒的抗凋亡基因已经被报道可以参与调控宿主的途径，但是具体的调控机制目前还尚不清楚[64-66]。

示意图,靶向,基因组,示意图

2017）等通过干扰病毒囊膜蛋白GP64的受体BmREEP和对 BmNPV 的感性[81, 82]。R/Cas9 技术进展R/Cas9 研究进展/Cas9 是细菌和古细菌在长期的进化过程中产生的用来种防御机制。1988 年，Ishino 等发现了大肠杆菌中有一发现这种重复序列广泛的存在于细菌和古细菌中[83]。20异性序列的特点，将其正式命名为成簇规律间隔短回Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR因[84]。2009 年，Marraffini 首先证明了 CRISPR 和 Cas 可以]。随着科学家们对 CRISPR/Cas 的研究加深，最终在cus pyogenes）中发现了 II 型 CRISPR/Cas 免疫系统 CRIS。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S881.2;Q78

【参考文献】