雌二醇对三疣梭子蟹卵巢发育和雌激素相关受体基因表达的影响

发布时间：2020-04-07 04:01

【摘要】：三疣梭子蟹是我国重要的海水养殖蟹类,池塘养殖三疣梭子蟹卵巢发育不良是困扰该产业的重要问题。雌二醇是甲壳动物体内十分重要的性类固醇激素,在卵巢发育过程中起到十分重要的作用。尽管池塘养殖三疣梭子蟹卵巢发育不良可能与雌二醇(E_2)分泌不足有关,但有关于其作用机制所知甚少。本研究首先采用免疫荧光的方法研究了三疣梭子蟹卵巢发育过程中E_2在卵巢、肝胰腺、胸神经节、脑神经节和大颚器中的分布及变化规律;此后,通过离体和活体实验研究了E_2对三疣梭子蟹卵巢发育、卵黄蛋白原(Vg)和雌激素相关受体(ERR)基因表达的影响;最后通过RNAi实验初步探讨了ERR基因在三疣梭子蟹卵巢发育过程中可能作用。具体研究结果如下:1.三疣梭子蟹卵巢发育过程中E_2的免疫定位本研究采用免疫组化的方法系统研究了卵巢发育过程中E_2在卵巢、肝胰腺、胸神经节、脑神经节和大颚器中的分布及变化。结果表明:(1)卵巢中E_2的免疫阳性主要分布于滤泡细胞和卵巢发育中后期的卵母细胞胞质(II-V期),随着卵巢的发育,卵母细胞胞质中的E_2免疫阳性呈现出先上升后下降的趋势,而滤泡细胞中则一直存在较强的E_2免疫阳性;(2)在肝胰腺(I-IV期)中,E_2的免疫阳性主要分布于F细胞及R细胞核中,其最大免疫阳性出现在卵巢发育IV期的肝胰腺中;(3)在神经组织(I-IV期)中,E_2主要分布于胸神经团的神经细胞和神经髓质以及脑神经节神经细胞的胞核内,并始终保持着强免疫阳性反应;(4)在大颚器(I-IV期)中,E_2强免疫阳性始终存在于大颚器腺细胞的核仁以及核周围的细胞质内。以上结果暗示,卵巢、肝胰腺、胸神经团、脑神经节和大颚器可能是三疣梭子蟹卵巢发育过程中E_2的主要作用靶点,不同靶器官间可能存在复杂的相互作用来共同调控卵巢发育。2.E_2对三疣梭子蟹卵巢发育相关基因表达的影响通过活体注射和离体调控两种手段来研究E_2对三疣梭子蟹卵巢发育、ERR和Vg基因表达的影响。结果表明:(1)对处于卵巢发育III期中期的三疣梭子蟹而言,不同浓度的外源E_2活体注射,对其卵巢指数和肝胰腺指数无显著影响;(2)注射不同浓度的外源E_2对卵巢和肝胰腺中ERR和Vg mRNA的表达量有显著影响,主要表现为不同浓度的外源E_2可促进卵巢和肝胰腺中Vg-mRNA的表达量显著升高,而ERR-mRNA的表达量则显著下降;(3)在神经组织和大颚器中,不同浓度的外源E_2均会降低ERR的表达量,推测E_2是通过调节ERR和Vg两种基因的拮抗表达来调控卵巢发育;(4)取卵巢发育处于III期的三疣梭子蟹的卵巢进行离体调控实验,结果表明10-8mol/L E_2可以显著提高卵巢中ERR-mRNA的表达水平。3.离体条件下三疣梭子蟹ERR RNA干扰体系的建立及其功能的初探首先通过体外逆转录合成3个不同的ERR dsRNA干扰片段,在26°C的恒温培养箱内,取III期卵巢离体干扰1h、2h、4h、8h,结果发现有一条干扰片段持续有效,干扰片段的浓度为2μg/ml。此后,对卵巢发育处于III期的卵巢组织进行4种不同处理的离体培养,分别为:2μg GFP dsRNA(A组)、2μg ERR dsRNA(B组)、2μg ERR dsRNA和10-8mol/L的E_2联用组(C组)及10-8mol/L E_2组(D组),结果发现,与A组相比,B组和C组中ERR基因的表达量显著下降,而D组ERR基因的表达量显著升高。这说明在本研究中筛选的ERR dsRNA可有效降低卵巢中ERR-mRNA的表达水平,10-8mol/L E_2可以显著提高卵巢中ERR-mRNA的表达水平。以上结果表明ERR在三疣梭子蟹卵巢发育的调控过程中起到十分重要的作用,E_2可能是通过作用于ERR的信号通路来调控卵黄发生,相关调控路径还需要进一步深入研究。
【图文】：

β结构

图1-2 ERα和ERβ 结构意图(Muramatsu and Inoue, 2000; Tong et al, 2002).3.2 雌激素膜受体1977 年，Pietras 等发现给予刺激后细胞内的基因水平将会迅速上调，因此可能存在膜性 ER(membrane estrogen receptor, mER)。随后，很多学者运用抗体结合、激光共聚焦等手段均证实了膜性 ER 的存在，并且发现雌激素膜受占 2%~3% (Pappas et al, 1995; Razandi et al, 1999)。核受体类似型膜受体可能核受体在转录过程中具有不同的剪切方式所造成的也可能是由核受体变异而的。mGPER1 是真正的 mER，mGPER1 与配体结合时均具有 mER 的特性，，，其他检测方法也提示其主要位于细胞膜上(Gobeil et al, 2006)。.3.3 雌激素的作用机制研究发现，雌激素的信号转导路径非常复杂。主要的雌激素信号转导路径有两种即：基因组途径和非基因组途径(图 1-3)。

制模,转导,核受体,雌激素膜受体

图1-2 ERα和ERβ 结构意图(Muramatsu and Inoue, 2000; Tong et al, 2002)1.3.2 雌激素膜受体1977 年，Pietras 等发现给予刺激后细胞内的基因水平将会迅速上调，因此推测可能存在膜性 ER(membrane estrogen receptor, mER)。随后，很多学者运用抗原抗体结合、激光共聚焦等手段均证实了膜性 ER 的存在，并且发现雌激素膜受体只占 2%~3% (Pappas et al, 1995; Razandi et al, 1999)。核受体类似型膜受体可能是由核受体在转录过程中具有不同的剪切方式所造成的也可能是由核受体变异而形成的。mGPER1 是真正的 mER，mGPER1 与配体结合时均具有 mER 的特性，同时，其他检测方法也提示其主要位于细胞膜上(Gobeil et al, 2006)。1.3.3 雌激素的作用机制研究发现，雌激素的信号转导路径非常复杂。主要的雌激素信号转导路径主要有两种即：基因组途径和非基因组途径(图 1-3)。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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