溪荪再生体系的建立及其转化GUS基因的研究

发布时间：2020-04-08 10:09

【摘要】：溪荪(Iris sanguinea)为鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属(Iris)草本宿根花卉,具有较高的观赏价值和药用价值,适应性较强,可在内蒙和东三省等寒冷北方地区露地越冬,但园林绿化中开发应用很少。为使溪荪野生花卉资源在有效的保护基础上进行高效的开发利用和新的种质资源培育,建立溪荪高效的组织培养再生体系十分重要,同时结合转基因分子育种的需要,在组培再生体系建立的基础上建立其遗传转化体系也十分必要。故本研究探讨了溪荪不同外植体、消毒方式、培养条件对其再生体系建立的影响,并进行了遗传转化的初步探究,为溪荪工厂化育苗、新品种培育和其转基因工程技术的研究奠定了基础。主要研究成果如下:(1)以溪荪种子为材料获取无菌苗,萌发试验采用MS培养基。首次研究获得高温浸种可作为溪荪种子最佳消毒处理方法,用80℃热水浸种1d后,以75%酒精灭菌30 s,再用4%NaCLO溶液消毒20min,其污染率仅为10.00%,发芽率可达 73.33%。(2)以溪荪种子萌发幼苗(2-3片叶,带胚根)为外植体,从胚轴部位直接诱导出不定芽,其最佳培养基配方为MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 1.0 mg/L,40d时诱导率高达93.33%,增殖系数高达5.30。最佳生根培养基的配方为MS+NAA0.5mg/L,30d时生根率为96.36%,移栽在园土:蛭石=2:1的栽培基质中生长30d后成活率在90%以上,苗生长状况良好。(3)不同外植体愈伤诱导结果:无菌苗根尖在培养基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+2,4-D2.0 mg/L中40d时愈伤诱导率为70%;叶未能诱导出愈伤;以花蕾与花葶连接处1-2 cm的花茎为外植体,采用75%酒精灭菌30s,再用2%NaC1O 消毒 8 min,愈伤诱导培养基为 MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L,40d时诱导率为54.48%;以溪荪种子萌发的胚根为外植体,培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.4 mg/L+2,4-D1.0 mg/L,40d 时愈伤诱导率高达 89.04%。愈伤增殖培养基为MS+6-BA0.5 mg/L+2,4-D0.5 mg/L,愈伤不定芽诱导最佳培养基配方均为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+KT0.5 mg/L,60d时花茎愈伤诱导不定芽分化率为46.03%,胚根愈伤诱导不定芽分化率为72.22%。(4)以溪荪花茎愈伤为遗传转化受体材料,初步研究认为Hyg浓度为40 mg/L时溪荪愈伤死亡率过半且不定芽的分化完全受抑制,可作为溪荪受体愈伤的筛选浓度;Carb浓度达到300 mg/L时能完全抑制农杆菌的生长,愈伤生长状况良好,可作为该受体材料的抑菌浓度。转化GUS基因过程中,最佳侵染时间为3 min,抗性愈伤的获得率高达38.89%;最适共培养时间为2d,筛选培养后获得的抗性愈伤较多,达34.45%,愈伤褐化率相对较低。
【图文】：

溪荪,蒴果

２＿１＿１试验材料逡逑溪荪种子分别于２０１５年９月和２０１６年９月采摘自东北林业大学帽儿山试验逡逑基地，在室内常规保存。溪荪蒴果（图２－１）于２０１６年７？９月采摘自东北林业大逡逑学试验苗圃。逡逑＿逡逑图２－１溪荪蒴果逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｉ．邋ｓａｎｇｕｉｎｅａ邋ｃａｐｓｕｌｅ逡逑２．１．２仪器设备逡逑高温高压蒸汽灭菌锅、红外灭菌器、超净工作台、不锈钢酒精灯、电子分析逡逑天平、移液枪、电磁炉、微波炉、ＰＨ剂等。逡逑２．２试验方法逡逑本章研宄不同消毒液浓度、消毒方式及不同浓度的生长调节物质（６－ＢＡ、ＮＡＡ逡逑和ＫＴ）对溪荪种子为外植体的不定芽再生体系的建立的影响。通过观察比较溪荪逡逑种子萌发各阶段的变化状况，分析各因素对种子萌发的影响，从而确定再生体系逡逑中种子发芽、不定芽增殖以及生根及移栽过程中最适的培养条件。逡逑培养环境条件一致，光照强度为２５ｐｍｏｌ／（ｍ２．邋ｓ），光照时间为１４ｈ／ｄ，同时保逡逑持培养室的培养温度在２５±１°Ｃ之间。逡逑２．２．１外植体的选取及预处理逡逑溪荪蒴果都是现采现用，挑选饱满的蒴果，放入洁净的硫酸纸袋带回实验室，逡逑将取回的蒴果滴加适量洗洁剂于流水下冲洗５？１０邋ｍｉｎ，去掉表面的杂质后用灭菌逡逑的纱布吸干果壳表面的水分备用。逡逑从室内保存的溪荪种子中人工挑选适量颗粒饱满的种子，先用稀释的洗洁剂逡逑水溶液搅拌清洗，去除杂质后将其置于流水下冲洗５？１０邋ｍｉｎ直至无泡沫产生为止，逡逑－１１－逡逑

溪荪,种子,不同时期,蒴果

图２－２溪荪不同时期未开裂蒴果的种子逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｓｅｅｄ邋ｏｆ邋ｕｎｄｅｈｉｓｃｅｎｔ邋ｃａｐｓｕｌｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｐｅｒｉｏｄｓ邋ｏｆ邋／．邋ｓａｎｇｕｉｎｅａ逡逑Ａ，邋７月初采摘蒴果消毒后接种的种子；Ｂ，邋８月初采摘蒴果消毒后接种的种子；Ｃ，初采摘蒴果消毒后接种的种子。逡逑ｔｅ：Ｆｉｇ．Ａ，邋Ｅａｒｌｙ邋Ｊｕｌｙ邋ｐｉｃｋｉｎｇ邋ｏｆ邋ｓｅｅｄｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｐｓｕｌｅ；Ｆｉｇ．Ｂ，邋Ｅｕｓｔ邋ｐｉｃｋｉｎｇ邋ｏｆ邋ｓｅｅｄｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｐｓｕｌｅ；Ｆｉｇ．Ｃ，邋Ｅａｒｌｙ邋Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ邋ｐｉｃｏｆ邋ｓｅｅｄｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｐｓｕｌｅ．逡逑２邋ＮａＯＨ处理对种子接种的影响逡逑试验结果（见表２－５）表明，用ＮａＯＨ去除溪荪种子种皮，以２％ＮａＣ１０ｉｎ对各处理的污染率无显著差异，污染低或无污染，最高仅为２．２３％。ＮａＯＨ浓度一致时，种子的发芽率随浸种时间的延长而降低，以５％ＮａＯ种２邋ｈ的种子消毒后发芽率可达５６．５３％。发芽种子生长一个星期左右部褐化直至死亡，其死亡率与浸种浓度和时间都成正比，呈上升趋势，，ＮａＯＨ溶液浸种８ｈ的种子，发芽率仅为３．４０％，并且发芽的种子后期都。试验中用低浓度ＮａＯＨ处理如时间较短难以去除溪荪种皮，而高浓度
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.19

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