菰黑粉菌PKA途径中UePkaC基因对极性生长机制的研究

发布时间：2020-04-09 05:23

【摘要】：菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种可以侵染茭白植株(Zizania latifolia)的内生活体营养真菌。其侵染茭白植株后能够抑制植株抽穗开花并引起植株茎部膨大形成可食用的茭白。在环境因素的影响下,菰黑粉菌形态可以完成从单核酵母型到双核菌丝型的转化,是一种典型的二型态病原真菌。菰黑粉菌的侵染能力及致病性与其二型态转化密切相关。前期研究发现,菰黑粉菌二型态的转化受MAPK信号途径和PKA信号途径共同调节。PKA全酶由两个催化亚基(PkaC)和两个调节亚基(PkaR)组成,不具有激酶活性。当第二信使cAMP与无活性的PKA调节亚基相结合后,能够诱导其构象发生变化,导致具有激酶活性的催化亚基被释放。本研究围绕PKA信号途径对菰黑粉菌生长,侵染及二形态转化的影响展开。本研究发现,外源添加cAMP后菌丝失去极性生长能力,单倍体菌株出芽后无法及时分裂,出现多位点芽殖的现象,且高浓度的cAMP影响性亲和菌株融合菌丝的生长。本研究推测PKA信号途径可能影响菰黑粉菌的极性生长。为进一步验证本研究的猜测,本研究对菰黑粉菌PKA信号途径催化亚基UePkaC基因进行深入研究。本研究克隆得到的菰黑粉菌PKA催化亚基UePkaC与玉米黑粉菌、玉米丝黑穗菌等的PKA催化亚基具有较高的同源性。通过同源重组将UePkaC敲除后发现,UePkaC不影响菰黑粉菌的生长速率,但UePkaC缺失导致菰黑粉菌菌体变长。UePkaC基因在融合初期便受到显著上调,且任意一方的UePkaC缺失都会导致两个性亲和单倍体无法融合,侵染实验也表明UePkaC缺失导致两个性亲和单倍体在植物表面无法正常形成双核菌丝侵染植物。UePkaC参与融合过程可能是因为其可以调控控制接合管生长的信息素基因表达。以上结果表明PKA信号途径可能参与调控菰黑粉菌单倍体的融合以及极性生长过程。Actin单体聚合形成微丝(F-actin),与真菌极性生长有密切关系。Actin的聚合(polymerization)以及解聚(depolymerization)受磷酸化调控。已有体外实验证明PKA可以直接磷酸化Actin,但体内尚缺乏实验支持。本研究克隆得到了菰黑粉菌UeActin基因,预测得到了UeActin基因上UePkaC基因的2个特异性磷酸化位点。本研究构建了UeT14::UeActin一个过表达菌株,UeT14::UeActin~(T204I),UeT14::UeActin~(T205I),UeT14::UeActin~(T204IT205I)3个过表达点突变菌株。通过与过表达菌株的对比,发现磷酸化位点被改变后菰黑粉菌的表型没有明显变化。通过免疫荧光实验,明确UeActin基因的亚细胞定位。对比UeT14::UeActin与UeT14△UePkaC::UeActin菌株中,但UeActin基因均呈现点状均匀分布于细胞内,本研究推测UePkaC基因可能不是通过磷酸化来调控UeActin基因从而影响菰黑粉菌的极性生长。UePkaC基因如何调控菰黑粉菌的极性生长,仍需要大量的实验去验证。
【图文】：

芽殖,外源,野生型菌,株形

3.1 第二信使 cAMP 影响菰黑粉菌的极性生长3.1.1 外源添加第二信使在 YEPS 液体培养基内加入本研究得到活力较好的菰黑粉菌添加 30 μMcAMP 的液体微镜下观察并取样。本研究芽的方式进行芽殖生长。生型菰黑粉菌不再以顶端出芽的方式生长黑粉菌出芽的位点发生了改变的出芽方式按时间顺序进行了一个统计比。结果显示，在外源添加着时间的推移多位点芽殖比例逐渐降低到 2%以下。而野生型菌株存在一定的的多位点芽殖现象cAMP 对菰黑粉菌单倍体极性生长的影响基内加入 30 μM 的 cAMP。将在经过活化、小摇菰黑粉菌。将菌液以 1:100 的体积比分别接入液体 YEPS 培养基中，12 h，24 h，36 h，48 h本研究发现野生型菰黑粉菌在 YEPS 液体培养基中以顶端出。而在外源添加 30 μMcAMP 的 YEPS 液体培养基中生型菰黑粉菌不再以顶端出芽的方式生长。在显微镜下，本研究观察到视野内菰黑粉菌出芽的位点发生了改变，出现多位点芽殖的现象(图 1A)。的出芽方式按时间顺序进行了一个统计，并计算了多位点芽殖在观察样品中的占在外源添加 cAMP 的样品中，多位点芽殖比例在(图 1B)。在 48 h 后，多位而野生型菌株，在晚期由于自生的衰老，芽殖位点出现错乱存在一定的的多位点芽殖现象。单倍体极性生长的影响小摇、扩摇后，接入普通及外源，60 h，在显液体培养基中，野观察到视野内菰。本研究对这样并计算了多位点芽殖在观察样品中的占在 12 h 最高，随多位点芽殖比例降芽殖位点出现错乱，也会

突变菌株,外源,野生型,菌丝

添加第二信使步探求第二信使的菌液混合，，点样在基上，12 h，，UeT14，UeT55显微镜下观察到菌丝生成。而在YEPS中加入能在光学显微镜下观察到接合管而无菌丝的生成（图 3.2），本研究向外扩展，菌丝长度大约在体培养基中，二信使 cAMP中国计量大学硕士学位论文cAMP 对菰黑粉菌融合的影响cAMP 对菰黑粉菌融合的作用，本研究点样在YEPS固体培养基和YEPS中加入3024 h，36 h，48 h ，60 h，72 h 进行观察菌株能够在 24 h 在细胞显微镜下观察显微镜下观察到菌丝生成；在 48 h，在体式显微镜下可以30 μM的cAMP的固体培养基上，本能在光学显微镜下观察到接合管而无菌丝的生成。观测后本研究可以观察到在 YEPS 培养基上，菌落的菌丝长度大约在 1500 μm。而在 YEPS 外源添，菌丝失去向外生长的能力被抑制，菌丝均匀能够抑制融合菌丝的极性生长。本研究进行观察在细胞显微镜下观察在体式显微镜下可以本观测后菌落菌丝均匀
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S645.2;S182

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