植物乳杆菌YM-4-3菌株中叶酸生物合成途径关键基因folP和folE的功能研究

发布时间：2020-04-10 04:31

【摘要】：叶酸具有重要的生理功能,随着叶酸生物合成途径的逐渐明朗,为了提高天然叶酸产量进而满足人类需求,研究叶酸生物合成关键基因或通过基因工程改变植物和微生物中叶酸的代谢受到相当重视。目前大量研究仅局限于通过过表达叶酸生物合成关键基因的方式来提高叶酸产量,而利用基因敲除技术针对基因本身的功能研究屈指可数。本研究通过同源重组的基因敲除技术对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)YM-4-3菌株的folE、folKE、folP基因进行敲除,从而研究它们对L.plantarum叶酸生物合成及生长的作用。对L.plantarum YM-4-3菌株中叶酸生物合成途径关键基因folE、folK、folP、folB及folQ进行序列比对及拼接后发现,这些基因在基因组中以基因簇形式存在;由此利用温度敏感型质粒pFED760通过同源重组构建了folE、folKE、folP基因的敲除株ΔfolE、ΔfolKE、ΔfolP,并通过PCR和DNA分子杂交(southern blot)技术进一步得到验证,同时证明这三个基因均为单拷贝基因。后期实验以ΔfolE、ΔfolKE、ΔfolP菌株作为研究对象,通过观察液体培养发现ΔfolP菌株进行沉淀生长,而ΔfolE和ΔfolKE菌株能均匀生长;扫描电镜和透射电镜分析结果显示,与野生型YM-4-3菌株相比,ΔfolE菌株的细胞形态未发生改变,而ΔfolKE与ΔfolP菌株的细胞形态发生较大变化,细胞与细胞间的黏附性增强,有些细胞形态呈不规则杆状,发生质壁分离,甚至出现凹陷,细胞壁破裂,内容物外泄等现象;通过对敲除株和野生株生长状态的动态监测发现,敲除株的生长速率和生物量明显低于野生株,生长周期延长且产酸能力减弱;叶酸产量的测定结果表明,各个菌株发酵液中叶酸含量随时间呈波动式增减,敲除株发酵液的叶酸总含量与野生株发酵液叶酸总含量差异较大。综上,证明folE、folKE、folP基因在叶酸生物合成及菌株生长中发挥重要作用,其中folP基因与菌株生长相关,而folKE与folP基因与细胞形态相关,且进一步证明folE与folK基因单独编码蛋白。利用表达载体pMG36e成功构建了folP基因的回补菌株H-folP与过表达菌株B-folP;荧光定量PCR分析结果显示,folP基因在H-folP菌株和B-folP菌株的表达量分别约为野生型YM-4-3菌株的177.87倍和40.28倍;但是H-folP菌株和B-folP菌株发酵液中叶酸含量相比野生型菌株低,故推测folP基因存在反馈抑制。本实验系统研究了叶酸生物合成途径中的关键基因folE、folKE、folP的生物学功能,为研究植物乳杆菌叶酸生物合成途径的分子调控机理奠定了理论基础,为探索植物乳杆菌其他叶酸生物合成途径提供了新思路。
【图文】：

结构图,叶酸,结构图,谷氨酸

第一章绪论叶酸简介.1 叶酸的结构与性质叶酸，，因从菠菜叶中提取纯化而得名。其化学名为蝶酰谷氨酸(pteroylglutamic ac种由蝶呤、对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid, pABA)和一个或多个谷氨酸结合而成性 B 族维生素，即维生素 B9。作为食品强化剂的合成叶酸(folic acid)常与天然叶ate)混淆，前者只含有一个谷氨酸尾巴而后者则是由多个谷氨酸尾巴组成(图 1.1)[1]。

叶酸,形式

图 1.2 参与一碳代谢的不同形式叶酸结构[3]Fig. 1.2 Structures of one-carbon metabolism folates[3]是一种无色无味的黄色或橙黄色的晶体或晶状粉末，加热至 250℃即行溶性维生素，但在 25℃的水中其溶解度仅为 0.0016 mg/mL，在沸水中、氢氧化钾等碱性溶液，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。叶酸在碱性或稳定，在酸性条件下极不稳定，在光照条件下，尤其是紫外线的照射下易要密封、避光储存[4]。酸的生理功能是参与几乎所有生物代谢的必须微量元素，因为在物质的合成和代谢中人无法离开叶酸而生存。一旦被机体吸收后，除了储存于肝脏的一部分 5 种具有活性的辅酶形式作为一碳单元的传送装置，从而参与 DNA 和 ]，氨基酸的代谢及血红蛋白的合成等生理代谢过程[6]。此外，叶酸中的量游离碳离子，它是形成神经末梢和构成传递神经冲动的重要化学原料
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】