马氏珠母贝肿瘤坏死因子受体及其相关因子基因的克隆与功能研究

发布时间：2020-04-14 16:47

【摘要】：肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)通过肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factors,TRAF)等信号分子介导信号传导通路参与宿主免疫防御,炎症,环境应激等生物过程。为了进一步研究其免疫功能,本研究基于转录组数据,筛选出马氏珠母贝肿瘤坏死因子受体及其相关因子关健基因,并进行基因克隆、组织定量、免疫刺激、基因沉默后的表达分析,并通过原核表达技术获得重组蛋白。主要研究结果如下:(1)马氏珠母贝TNFR和TRAF基因的克隆与定量分析:本研究成功克隆得到PmTNFR1、PmTNFR2、PmTNFR5(CD40)、PmTRAF2和PmTRAF4的c DNA全长序列,分别编码406、427、533、527和470个氨基酸。通过序列分析发现PmTNFR1、PmTNFR5分别存在两个和三个TNFR家族半胱胺酸丰富结构域,一个跨膜结构域和一个死亡结构域;PmTNFR2存在两个TNFR域和一个跨膜域;PmTRAF2存在一个RING指结构域、两个锌指结构域、一个Coiled-coil结构、一个c IAP2结合位点和一个TRAF结构域,PmTRAF4存在三个锌指结构域和一个TRAF结构域。组织定量结果显示5个基因在免疫组织鳃和肝胰腺中表达量显著高于其它检测组织。(2)脂多糖(LPS)刺激、植核移植刺激条件下,5个基因在血淋巴中的表达谱:LPS刺激后,PmTNFR1和PmTNFR5基因的表达量在48 h显著上调,PmTNFR2基因的表达量在6 h和48 h显著上调;PmTRAF2基因的表达量在6 h和48 h显著上调,PmTRAF4基因在6 h显著高表达。植核后的不同时期,PmTNFR1和PmTNFR2基因的表达量在15 d显著上调,PmTNFR5在5 d和15 d表达量显著上调;PmTRAF2基因的表达量在5 d、15 d和30 d显著上调,PmTRAF4表达水平没有显著性差异。结果表明了这5个基因参与了马氏珠母贝免疫应答反应。(3)免疫刺激后NF-κB信号通路关健信号分子的表达分析:运用Real-time PCR检测了LPS刺激和植核移植后信号分子LITAF、TRADD、TRAF2、NIK、IKK和NF-κB的表达情况。已知PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5在LPS刺激后的48 h显著上调,在植核后的第15 d表达量上调。分析数据发现这些信号分子的表达量的表达模式与PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5相似。说明PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5可能介导的NF-κB通路参与机体的免疫应答反应。(4)RNAi技术研究信号通路:运用Real-time PCR检测PmTNFR1和PmTNFR5基因沉默后自身及其下游信号分子的表达情况。结果显示:PmTNFR1在第4 d表达量显著下调,且下游基因TRADD、Caspase-8、Caspase-3、TRAF2、NIK、IΚΚ和NF-κB具有相同的抑制表达模式;PmTNFR5在第1 d表达量显著下调,检测其下游基因TRAF2、NIK、IΚΚ和NF-κB具有相同的抑制表达模式。推测马氏珠母贝通过TNFR1介导的细胞凋亡通路和NF-κB信号通路,以及TNFR5介导的NF-κB信号通路参与调控机体的免疫反应。(5)成功构建了pET-15b-PmTNFR5和pET-15b-PmTRAF2原核表达载体,并经过诱导和纯化成功获得重组蛋白。
【图文】：

信号通路

图 1-1 TNFR1 信号通路[113]Fig. 1-1 TNFR1 signaling pathway 介导的信号通路FR 1信号转导途径的研究相比，我们对TNFR2信号通路的认FR2与TNF-a结合后，主要募集TRAF 1-3，cIAP-1、cIAP-2蛋白增加，激活NF-κB，抑制细胞凋亡[49]。其中最主要的 1-3介导激活NF-κB，进而促使细胞存活（图1-2）。

信号通路,肿瘤坏死因子受体

图1-2 TNFR2介导的NF-κB信号通路Fig .1-2 TNFR2-mediated NF-κB signaling pathway介导的信号通路肿瘤坏死因子受体家族成员一样，CD40募集几种不同的肿以介导包括NFκB，，c-Jun N末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激激活[67]。已有研究发现TRAF2，3 或TRAF6 介导了CD40TRAF6和TRAF2介导响应于CD40接合的经典和非经典NF激活CD40后，通过衔接蛋白TRAFs 家族成员可以介导两条D40-（TRAF2、TRAF3)-NF-κB和CD40-TRAF6-NF-κB。研TRAF6介导活化NF-κB，TRAF2与CD40-C结构域结合介导，且两者在NF-κB活化中所占的比例存在差异[115]（图1-3
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】