STAT3基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离与鉴定

发布时间：2020-04-16 23:39

【摘要】：目的:既往研究显示大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BMSCs-exosomes)富含信号转导及转录激活因子3(STAT3)蛋白,但干细胞源外泌体是否能够通过传递STAT3蛋白的方式修复梗死心脏,目前尚未证实。为证明该假说,本实验采用携带增强型绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒表达载体,构建过表达STAT3基因及RNA干扰STAT3基因慢病毒,分别转染骨髓间充质干细胞(BMSCs),然后提取各自来源的外泌体(exosomes),在蛋白水平上修饰exosomes,为下一步研究干细胞exosmes的作用机制奠定基础。方法:(1)原代细胞分离培养:取SD大鼠双侧股骨、胫骨,用培养基冲洗骨髓腔收集冲洗液贴壁培养骨髓间充质干细胞。(2)流氏细胞仪:检测BMSCs表面特异性标记物。(3)慢病毒载体的构建:构建过表达STAT3基因及siRNA-STAT3基因的慢病毒载体用以转染293T细胞并包装慢病毒。(4)BMSCs慢病毒感染:分别以携带STAT3过表达和siRNA-STAT3慢病毒感染BMSCs,获得STAT3基因修饰的BMSCs。(5)免疫荧光显微镜:检测携带GFP慢病毒载体转染后BMSCs内荧光蛋白表达。(6)外泌体分离试剂盒:分离获得外泌体。(7)Western blot:检测exosomes特异性标记物CD9/CD63/CD81及STAT3总蛋白。(8)透射电镜:观察所分离得到外泌体的形态。结果:(1)提取骨髓原代MSCs为长梭型,两端有较长突起,均匀分布生长,当细胞融合度达到90%以上,呈漩涡样分布。(2)取第四代BMSCs做流氏表型分析发现皆表达CD29/CD44/CD90/CD105,其中CD90的表达阳性率高达99%;均不表达CD34和CD45,说明两种细胞均表达典型的干细胞表面标记并且细胞纯度较高。(3)免疫荧光显微镜观察到293T细胞被转染呈现绿色荧光,以MOI值为8的慢病毒感染BMSCs后,通过免疫荧光显微镜能够观察到大量的绿色荧光表达,提示感染成功。(4)用外泌体分离纯化试剂盒按说明书提取的沉淀即为exosomes,于-80°C保存。(5)Western blot检测发现提取的外泌体表达CD9/CD81/CD63,符合外泌体标志蛋白。(6)Western blot检测发现BMSCs所分离的外泌体表达STAT3,进行慢病毒转染后,过表达STAT3-BMSCs-exosomes对STAT3表达升高;siRNA-STAT3-BMSCs-exosomes对STAT3表达降低。(7)透射电镜下可见BMSCs-exosomes呈圆形或椭圆形,直径在30-100nm,有典型的杯底凹槽样结构。结论:1.骨髓间充质干细胞来源的外泌体富含STAT3蛋白2.慢病毒转染后,过表达STAT3使相关外泌体STAT3明显升高;干扰Si-STAT3使相关外泌体STAT3明显下降。3.过表达STAT3及siRNA-STAT3慢病毒载体转染MSCs外泌体的分离获取为下一步研究干细胞exosomes通过传递STAT3蛋白修复梗死心脏的作用及机制奠定了坚实的基础。
【图文】：

代 BMSCs（×400，细胞融合约 40%）；C. 第 4 代 BMSCs（×100，细胞融合约90%以上）。1.2 骨髓间充质干细胞的表型特征为探究细胞的表型特征，，取第 4 代 BMSCs 用流式的方法做了免疫表型分析。流氏细胞仪检测 CD29、CD44、CD90、CD105 阳性率均表达 99%以上；均不表达CD34和CD45，说明两种细胞均表达典型的干细胞表面标记并且细胞纯度较高。说明培养的第 4 代 BMSCs 具有 MSCs 的特异性表型特征。进一步证明本实验提取的骨髓细胞为间充质干细胞。

泳道 10:GPH-r_STAT3-SH2 酶切 1泳道 11:GPH-r_STAT3-SH2 酶切 2泳道 12:GPH-r_STAT3-SH2 酶切 3泳道 13:GPH-r_STAT3-SH3 质粒泳道 14:GPH-r_STAT3-SH3 酶切 1泳道 15:GPH-r_STAT3-SH3 酶切 2泳道 16:GPH-r_STAT3-SH3 酶切 33. 慢病毒的包装及滴度检测3.1 STAT3 慢病毒的成功包装构建好的带有荧光蛋白GFP表达质粒通过转染试剂lipofectamin 2000转染293T细胞 24h 后，通过荧光显微镜观察到细胞被转染呈现绿色荧光，表明 STAT3 载体转染 293T 细胞成功(图 5)。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.22

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本文编号：2630172