碳纳米管作为重组质粒pEGFP-vp5基因转运载体的研究

发布时间：2017-03-23 12:05

  本文关键词：碳纳米管作为重组质粒pEGFP-vp5基因转运载体的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着基因功能研究的深入,细菌转化、细胞转染等目前已成为实验室工作中经常涉及的基因功能研究的基本方法,寻找一种携载率高、穿膜能力强、成本低、细胞毒性小的载体作为基因转运载体,对基因功能的研究和应用具有重要意义。功能化碳纳米管(Functionalized Carbon nanotubes,f-CNTs)可以有效地为药物、氨基酸、核酸、蛋白质等生物活性分子提供连接位点,并携载其穿透组织、细胞的膜屏障顺利进入胞内发挥生物学作用。vp5基因表达产物为草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP5外壳蛋白,由于具有良好的免疫原性成为草鱼出血病疫苗研究的焦点。本研究通过化学修饰的功能化碳纳米管连接重组真核表达质粒pEGFP-vp5系统进行大肠杆菌(BL21)转化、草鱼肾细胞(CIK)转染、进一步浸浴草鱼,基于转染效率、免疫保护作用等筛选合适的碳纳米管载基因转运系统,并验证碳纳米管作为载体的基因转运效果。取得的结果如下:1.采用真核重组技术构建真核表达质粒pEGFP-vp5,并经静电吸附作用与四种不同侧链修饰的氨基化多壁碳纳米管(MWCNTs-NH3+:S1、S2、S3、S4)进行连接,制备碳纳米管载基因系统(MWCNTs-pEGFP-vp5),MWCNTs-pEGFP-vp5经孵育转化大肠杆菌(BL21),结果显示:S4携带重组质粒pEGFP-vp5转化大肠杆菌,转化效果极好;两者的最佳配比(S4:DNA)为8:1;重组质粒pEGFP-vp5的适宜用量为20 ng;操作简便、成本较低。说明氨基化多壁碳纳米管有望成为优良的细菌转化载体。2.四种不同修饰的MWCNTs-NH3+(S1、S2、S3、S4)承载重组质粒pEGFP-vp5构成碳纳米管载基因系统(MWCNTs-pEGFP-vp5),MWCNTs-pEGFP-vp5经温育转染CIK细胞。琼脂糖凝胶电泳测定结果表明:氨基化碳纳米管可以不同程度吸附质粒pEGFP-vp5;扫描电子显微镜图像显示:CIK细胞对MWCNTs-NH3+存在很大的亲和力,碳纳米管覆盖在细胞表面且多数垂直插在胞膜上,像针一样刺入细胞;透射电子显微镜图像证实:MWCNTs-NH3+穿透了细胞膜,并且分散到了CIK细胞中。随后的研究证实,MWCNTs的修饰方式及其与质粒DNA配比是决定转染效率的重要因素,S4显示较好的转染效果,其与质粒DNA最佳配比为6:1。氨基化多壁碳纳米管有望成为优良的细胞转染载体。3.基于氨基化多壁碳纳米管(S4)、氨基化单壁碳纳米管(修饰方法同S4)和质粒pEGFP-vp5组成了碳纳米管载核酸疫苗系统(CNTs-pEGFP-vp5),将CNTs-pEGFP-vp5经肌肉注射和浸浴免疫草鱼,结果表明:S4不适合作为pEGFP-vp5疫苗的载体免疫草鱼;对于氨基化单壁碳纳米管(SWCNTs-NH3+),SWCNTs-pEGFP-vp5免疫组相比质粒pEGFP-vp5免疫组vp5基因的表达水平、特异性抗体水平、免疫相关基因表达水平及相对存活率均显著增高;此外,SWCNTs-pEGFP-vp5(5μg/尾)肌肉注射免疫组和SWCNTs-pEGFP-vp5(20 mg/L)浸浴免疫组均观察到良好的免疫保护作用,浸浴免疫达到了注射免疫的效果。氨基化SWCNTs可以作为水产核酸疫苗的有效载体,通过浸浴免疫达到肌肉注射免疫的免疫保护效果,其在水产疫苗方面有广阔的应用前景。综上所述,利用碳纳米管的细胞穿透性,经过特殊化学修饰的碳纳米管可以作为外源基因pEGFP-vp5在大肠杆菌BL21、CIK细胞甚至草鱼活体中基因转运的载体。为功能化碳纳米管作为基因转运载体的应用奠定了基础。
【关键词】：碳纳米管 pEGFP-vp5 细菌转化 细胞转染 免疫保护
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-21
• 1.1 草鱼出血病病原简介12
• 1.2 草鱼出血病预防和控制12-13
• 1.3 基因转运方法13-14
• 1.4 碳纳米管载体简介14-15
• 1.4.1 碳纳米管的制备方法15
• 1.5 碳纳米管的细胞穿透机制15-16
• 1.5.1 打孔式穿过胞膜15
• 1.5.2 依赖能量的内吞作用15-16
• 1.5.3 能量不依赖的非内吞作用16
• 1.5.4 扩散作用16
• 1.6 碳纳米管的功能化修饰16-17
• 1.6.1 共价修饰16-17
• 1.6.2 非共价修饰17
• 1.7 功能化碳纳米管在生物医学方面的应用17-19
• 1.7.1 作为药物分子载体的研究17-18
• 1.7.2 协助多肽和蛋白质转运的研究18
• 1.7.3 协助基因转运的研究18-19
• 1.8 碳纳米管对水生生物的毒性研究19
• 1.9 选题的目的和意义19-21
• 第二章 碳纳米管载重组质粒pEGFP-vp5转化大肠杆菌的研究21-29
• 2.1 材料与方法21-24
• 2.1.1 试验材料21
• 2.1.2 主要试剂和仪器21
• 2.1.3 草鱼呼肠孤病毒vp5基因的扩增21-22
• 2.1.4 重组质粒pEGFP-vp5的构建及鉴定22-23
• 2.1.5 功能化碳纳米管的修饰23-24
• 2.1.6 碳纳米管载pEGFP-vp5转化系统的构建24
• 2.1.7 碳纳米管对大肠杆菌的毒性评估24
• 2.1.8 最优碳纳米管种类及配比的筛选24
• 2.2 结果与分析24-28
• 2.2.1 重组质粒pEGFP-vp5构建与鉴定24-25
• 2.2.2 功能化碳纳米管的结构25-26
• 2.2.3 最优碳纳米管修饰方式26
• 2.2.4 S4与重组质粒pEGFP-vp5的最佳配比26-27
• 2.2.5 重组质粒的合适用量27-28
• 2.3 讨论28
• 2.4 小结28-29
• 第三章 碳纳米管载重组质粒pEGFP-vp5转染草鱼肾细胞（CIK）的研究29-36
• 3.1 材料与方法29-31
• 3.1.1 试验细胞29
• 3.1.2 主要试剂和仪器29
• 3.1.3 多壁碳纳米管的氨基化修饰29
• 3.1.4 重组质粒pEGFP-vp5的构建29
• 3.1.5 MWCNTs-NH3+: pEGFP-vp5复合物的制备29-30
• 3.1.6 凝胶电泳分析MWCNTs-NH3+:DNA的最佳配比30
• 3.1.7 扫描电镜和透射电镜分析样品的制备30
• 3.1.8 RT-PCR检测vp5在CIK细胞中的表达30-31
• 3.1.9 统计分析31
• 3.2 结果与分析31-34
• 3.2.1 MWCNTs-NH3+: pEGFP-vp5复合物的琼脂糖凝胶电泳31
• 3.2.2 扫描电镜和透射电镜分析31-32
• 3.2.3 MWCNTs-NH3+递送质粒pEGFP-vp5进入细胞能力的评估32-33
• 3.2.4 vp5基因在CIK细胞中的表达33-34
• 3.3 讨论34-35
• 3.4 小结35-36
• 第四章 碳纳米管载重组质粒pEGFP-vp5免疫草鱼的研究36-53
• 4.1 材料与方法36-40
• 4.1.1 试验病毒与动物36
• 4.1.2 主要试剂和仪器36-37
• 4.1.3 单壁碳纳米管的氨基化修饰37
• 4.1.4 重组质粒pEGFP-vp5的构建37
• 4.1.5 碳纳米管载pEGFP-vp5疫苗系统的构建37
• 4.1.6 碳纳米管载疫苗毒性评估37-38
• 4.1.7 碳纳米管载核酸疫苗免疫草鱼38
• 4.1.8 肌肉组织中重组质粒检测38
• 4.1.9 肌肉组织中重组质粒表达检测38
• 4.1.10 免疫相关基因表达的测定38-39
• 4.1.11 抗体效价测定39
• 4.1.12 攻毒试验及病毒的检测39-40
• 4.1.13 统计分析40
• 4.2 结果与分析40-50
• 4.2.1 毒性评估40
• 4.2.2 肌肉组织内pEGFP-vp5的持久性40-41
• 4.2.3 肌肉组织内vp5基因的表达41-43
• 4.2.4 免疫相关基因的表达分析43-44
• 4.2.5 疫苗的免疫保护44-47
• 4.2.6 抗体效价测定47-48
• 4.2.7 不同组织中病毒的检测48-50
• 4.3 讨论50-52
• 4.4 小结52-53
• 结论53-54
• 参考文献54-60
• 附录60-63
• 致谢63-64
• 作者简介64

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1 王元;碳纳米管作为重组质粒pEGFP-vp5基因转运载体的研究[D];西北农林科技大学;2016年

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