甘蓝枯萎病抗性基因FOC1相关SNP与互作蛋白的筛选与初步分析

发布时间：2017-03-23 19:06

  本文关键词：甘蓝枯萎病抗性基因FOC1相关SNP与互作蛋白的筛选与初步分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在已成功克隆甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的基础上,本研究筛选了FOC1相关的单核苷酸多态性(SNP)位点,并对SNP基因序列以及氨基酸序列进行了一定程度的分析,发掘了与甘蓝枯萎病抗性基因FOC1相关的特异性SNP,为进一步开发FOC1特异分子标记提供理论依据。与此同时,本研究构建了酵母诱饵菌株Y2HGold[pGBKT7-FOC1],利用酵母双杂交技术验证了其自激活及毒性作用,从而在甘蓝均一化cDNA文库中筛选到与甘蓝枯萎病基因FOC1表达蛋白互作的猎物蛋白,研究结论如下:1.本试验在对11份甘蓝自交系材料枯萎病抗病表型鉴定基础上,通过基因测序对每份材料中的FOC1等位基因及相应的氨基酸序列变异进行分析。结果表明,FOC1等位基因序列之间共存在92处SNP变异和2处Indel变异,其中包含C381A/G等18个在抗、感材料中表现出特异性差异的SNPs。此18个特异的SNP中转换型比率为86.11%、颠换型比率为13.89%,4种碱基变异率以T/C、G/A最高,分别占47.22%和38.89%,C/G和A/C变异率共占13.89%。同时,抗、感材料中共有23处氨基酸变异,在5份抗病材料中,除P10外的其余自交系均有一个氨基酸变异(H34D),该变异未造成氨基酸的亲/疏水性变化,可能不影响该基因的功能。另外,本研究也发现抗、感材料中存在4个特异的SNP,可造成3个氨基酸的变化。2.建立在已成功克隆甘蓝枯萎病抗性基因FOC1的基础上,利用酵母双杂交技术构建了诱饵质粒载体pGBKT7-FOC1,并成功转入酵母菌株Y2HGold,形成了酵母诱饵菌株Y2HGold[pGBKT7-FOC1],同时进行自激活及毒性检测。经试验可知融合蛋白本身不具有激活ADE2等报告基因的能力,即pGBKT7-FOC1在酵母中无自激活作用。诱饵酵母菌株Y2HGold[pGBKT7-FOC1]菌液的OD600值与空白对照Y2HGold[pGBKT7]的OD600两者相差不大并且均大于0.8,说明诱饵载体pGBKT7-FOC1对宿主细胞无自毒作用。试验证明基因FOC1不会对酵母Y2HGold菌株的生长产生较大的影响,酵母菌可以正常生长,可用于甘蓝均一化cDNA文库的筛选。3.根据酵母双杂交系统技术,利用上述所得的酵母诱饵菌株Y2HGold[pGBKT7-FOC1]筛选甘蓝均一化cDNA文库,最终试验结果显示,经过初步筛选和回转验证证明,与甘蓝枯萎病抗性基因FOC1表达蛋白互作的蛋白的基因分别为FOC1 A、FOC1 B、FOC1 C以及FOC1 D。将其序列提交至NCBI、BRAD和TAIR数据库中进行同源性比对,获得有匹配结果的候选蛋白,并发现FOC1 D基因的注释为磷酸核酮糖激酶,它可能存在与甘蓝枯萎病抗逆性相关的作用,这为将来研究甘蓝抗枯萎病育种这一重要性状提供相关的线索,为我们接下来的研究工作做了充分的准备。
【关键词】：甘蓝枯萎病 FOC1 SNP 酵母双杂交 互作蛋白
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.5
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-5
• 缩略词表5-9
• 第一章 文献综述9-18
• 1.1 甘蓝的概述及价值9-10
• 1.1.1 甘蓝类作物及其栽培变种9
• 1.1.2 甘蓝的价值9-10
• 1.2 甘蓝枯萎病概述及特征10-12
• 1.2.1 甘蓝枯萎病的概述10
• 1.2.2 甘蓝枯萎病发生和发展10-11
• 1.2.3 甘蓝枯萎病致病菌概述11
• 1.2.4 甘蓝枯萎病的综合防治11-12
• 1.3 SNP的概述及应用12-13
• 1.3.1 SNP的概述12
• 1.3.2 SNP的应用12-13
• 1.4 酵母双杂交技术简介13-15
• 1.4.1 酵母双杂交技术的原理13-14
• 1.4.2 酵母双杂交技术应用14-15
• 1.5 研究意义15-18
• 1.5.1 研究基础15-16
• 1.5.2 研究目的16-18
• 第二章 甘蓝枯萎病抗性基因FOC1相关SNP的筛选18-30
• 2.1 材料18
• 2.1.1 试验材料18
• 2.1.2 菌种来源及孢子悬浮液18
• 2.2 方法18-19
• 2.2.1 枯萎病接种方法18-19
• 2.2.2 病情调查19
• 2.2.3 DNA提取及引物设计19
• 2.2.4 PCR扩增及测序19
• 2.2.5 基因序列分析19
• 2.3 结果与分析19-28
• 2.3.1 11份甘蓝材料抗枯萎病表型及分子鉴定19-20
• 2.3.2 11份甘蓝材料中FOC1等位基因的序列分析20-25
• 2.3.3 抗、感材料中FOC1等位基因特异变异分析25-26
• 2.3.4 抗、感材料中FOC1等位基因的氨基酸序列变异分析26-28
• 2.4 小结与讨论28-30
• 第三章 酵母诱饵菌株的构建30-40
• 3.1 材料30-31
• 3.1.1 试验材料30-31
• 3.1.2 酶及主要试剂31
• 3.1.3 主要仪器设备31
• 3.2 方法31-35
• 3.2.1 诱饵质粒载体pGBKT7-FOC1的构建与鉴定31-33
• 3.2.2 诱饵酵母菌株Y2Hgold [pGBKT7-FOC1]制备33-34
• 3.2.3 诱饵质粒pGBKT7-FOC1自激活检测34
• 3.2.4 诱饵质粒pGBKT7-FOC1毒性检测34-35
• 3.3 结果与分析35-38
• 3.3.1 诱饵载体pGBKT7-FOC1重组质粒的构建和分析35
• 3.3.2 酵母菌株Y2HGold表型鉴定35-36
• 3.3.3 pGBKT7-FOC1转化酵母菌Y2HGold36-37
• 3.3.4 诱饵质粒pGBKT7-FOC1的自激活检测37-38
• 3.3.5 诱饵质粒pGBKT7-FOC1毒性检测38
• 3.4 小结与讨论38-40
• 第四章 甘蓝抗枯萎病基因FOC1互作蛋白的筛选40-49
• 4.1 材料40-41
• 4.1.1 酵母诱饵菌株与甘蓝cDNA文库40
• 4.1.2 主要试剂40-41
• 4.1.3 主要仪器设备41
• 4.2 方法41-43
• 4.2.1 Mating法筛选与FOC1基因表达蛋白的互作蛋白41-42
• 4.2.2 初步筛选候选克隆42
• 4.2.3 菌落验证42-43
• 4.2.4 获得阳性候选猎物质粒43
• 4.2.5 阳性候选猎物质粒回转验证43
• 4.2.6 阳性候选基因测序及分析43
• 4.3 结果与分析43-47
• 4.3.1 杂交观察43-44
• 4.3.2 阳性候选克隆的筛选和鉴定44-45
• 4.3.3 获得单一文库质粒45-46
• 4.3.4 单一文库质粒回转验证46
• 4.3.5 互作蛋白相关基因生物信息学分析46-47
• 4.4 小结与讨论47-49
• 第五章 结论49-50
• 参考文献50-56
• 致谢56-57
• 作者简介57-58
• 导师简介58-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张静;梁卫红;;2种非生物胁迫和7种激素对水稻OsAQP基因表达的影响[J];河南师范大学学报(自然科学版);2016年01期

2 郑鹏茜;刘立根;;骨髓增生异常综合征伴获得性α地中海贫血中X连锁α地中海贫血伴智力障碍基因突变的研究进展[J];国际输血及血液学杂志;2015年05期

3 谢光蓉;赵百学;王e

本文编号：264374