基于环介导等温扩增转基因成分可视化检测技术研究

发布时间：2017-03-23 21:00

  本文关键词：基于环介导等温扩增转基因成分可视化检测技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种快速、灵敏度高、特异性强的等温核酸扩增技术,已被广泛用于各领域。同时,LAMP的高灵敏度也使扩增产物开盖检测极易出现污染,而利用闭管检测技术能有效降低污染机率。目前,LAMP结果检测方法主要有电泳、浊度分析、荧光染料、LFD、微流控等,其中应用较多的是电泳、浊度分析、HNB以及SYBR Green I指示剂。现有方法存在需开盖、材料昂贵、颜色变化均属同一色系等不足,为此本实验进行了三项独立的研究,主要研究成果如下:(1)LAMP-ACBK检测系统:本实验引入一种新型的金属指示剂-酸性络蓝K(Acid Chrome Blue K,ACBK)建立了闭管LAMP结果可视化检测技术。首先,我们在LAMP扩增的起始体系中,分别测试了ACBK与缓冲液、dNTPs、引物、Mg2+等组分的反应,确定了含ACBK的LAMP体系其颜色变化由Mg2+决定,化学方法也进一步验证了这一结论。随后以花椰菜花叶病毒35S启动子(CAMV35S,35S)为靶基因,建立了35S LAMP-ACBK检测体系。该体系的检测灵敏度针对转基因水稻的检测限为100拷贝,在分别含有50 ng的水稻、大豆、油菜和玉米基因组中能检测出0.1%的转基因含量。同时,利用不同转化事件及不同转基因作物为材料验证了其检测特异性,结果表明构建的35S LAMP-ACBK检测系统具有很强的检测特异性。最终,将该检测体系成功用于对实际玉米样品转基因成分的检测,检测结果既可以裸眼直接判断也可以借助紫外可见光谱分析。(2)LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统:以G-四联体过氧化物酶实验所产生的绿色为基础建立了LAMP扩增和结果可视化检测技术。首先,在LAMP扩增体系中分别加入(FIP/BIP,FLP/BLP),(FIP/BIP-G4,FLP/BLP),(FIP/BIP,FLP/BLP-G4),(FIP/BIP-G4,FLP/BLP-G4)四组引物组合,在63°C(12,24,36,48,60)min,85°C 2 min扩增条件下扩增,确定了(FIP/BIP,FLP/BLP-G4)为LAMP扩增引物。随后以含35S的转基因材料模板,建立了35S LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统,且该系统针对转基因水稻的检测限为32 ng/μL。同时,利用不同转化事件及不同作物的转基因材料验证了其检测特异性,结果表明构建的35S LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统具有很强的检测特异性。(3)LAMP-试纸条检测系统:本研究旨在建立一种基于试纸条的35S或TNOS的LAMP扩增结果检测方法,该方法在LAMP扩增结束后2-3 min内即可用肉眼判读结果。首先对修饰后的LAMP引物做了可用性检测,随后,对试纸条的特异性及灵敏度进行了评价。结果显示,评价所用的5种阳性样品均出现质控线与检测线,电泳呈特异的梯状条带,与普通PCR结果一致。表明该试纸条可用于35S及TNOS LAMP扩增结果的检测,且有较高的特异性,两种试纸条的灵敏度分别为5.4 ng/μL、27.2 ng/μL。
【关键词】：环介导等温扩增(LAMP) 酸性络蓝K(ACBK) G-四联体过氧化物酶 试纸条 可视化
【学位授予单位】：沈阳师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 引言9-18
• 1.1 国内外研究概况9-12
• 1.1.1 电泳10
• 1.1.2 荧光染料法10-11
• 1.1.3 基于镁离子、焦磷酸根的检测技术11-12
• 1.1.4 与其他技术结合的检测技术12
• 1.2 本论文研究目的、意义与主要研究内容12-14
• 1.2.1 研究目的和意义12-13
• 1.2.2 主要研究内容13-14
• 1.3 实验原理14-18
• 1.3.1 LAMP-ACBK检测系统14-16
• 1.3.2 LAMP-G-四联体过氧化物酶检测系统16
• 1.3.3 LAMP-试纸条检测系统16-18
• 第二章 ACBK可视化检测LAMP扩增结果18-27
• 2.1 材料和方法18-20
• 2.1.1 材料18-19
• 2.1.1.1 实验材料18
• 2.1.1.2 实验试剂18
• 2.1.1.3 主要仪器设备18
• 2.1.1.4 引物18-19
• 2.1.2 方法19-20
• 2.1.2.1 DNA提取19
• 2.1.2.2 DNA扩增19
• 2.1.2.3 扩增结果分析19
• 2.1.2.4 ACBK在LAMP体系中的可行性分析与浓度筛选19-20
• 2.1.2.5 LAMP-ACBK体系优化20
• 2.1.2.6 LAMP-ACBK特异性与灵敏度实验20
• 2.1.2.7 LAMP-ACBK对实际样品的检测20
• 2.2 结果与分析20-25
• 2.2.1 ACBK指示剂在LAMP体系中的可行性分析20-21
• 2.2.2 LAMP扩增体系确定21-22
• 2.2.3 特异性22-23
• 2.2.4 灵敏度23-24
• 2.2.5 对实际样品的检测24-25
• 2.3 讨论25-27
• 第三章 G四联体可视化检测LAMP扩增结果27-34
• 3.1 材料27-28
• 3.1.1 实验材料27
• 3.1.2 试剂27
• 3.1.3 主要仪器设备27
• 3.1.4 引物27-28
• 3.2 方法28-29
• 3.2.1 DNA提取28
• 3.2.2 DNA扩增28
• 3.2.3 G-四联体过氧化物酶实验28
• 3.2.4 hemin指示浓度及检测液加样量筛选28-29
• 3.2.5 特异性与灵敏度实验29
• 3.3 结果与分析29-32
• 3.3.1 引物G4序列对LAMP扩增影响29-30
• 3.3.2 hemin指示浓度及检测液加样量筛选30-31
• 3.3.3 特异性31
• 3.3.4 灵敏度31-32
• 3.4 讨论32-34
• 第四章 试纸条可视化检测LAMP扩增结果34-39
• 4.1 材料和方法34-35
• 4.1.1 材料34-35
• 4.1.1.1 实验材料34
• 4.1.1.2 实验试剂34
• 4.1.1.3 主要仪器设备34
• 4.1.1.4 引物34-35
• 4.1.2 实验方法35
• 4.1.2.1 DNA提取35
• 4.1.2.2 DNA扩增35
• 4.1.2.3 试纸条检测LAMP扩增结果35
• 4.1.2.4 特异性与灵敏度实验35
• 4.2 结果与分析35-37
• 4.2.1 特异性35-36
• 4.2.2 灵敏度36-37
• 4.3 讨论37-39
• 结论39-40
• 参考文献40-44
• 个人简历44-45
• 致谢45

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  本文关键词：基于环介导等温扩增转基因成分可视化检测技术研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：264540