江南卷柏GST基因家族的功能进化研究

发布时间：2017-03-24 09:12

  本文关键词：江南卷柏GST基因家族的功能进化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferases)是一类在生物体中广泛存在的的蛋白质超家族。它在生物体内具有解毒抗逆,响应胁迫,信号传导等重要功能。之前对于植物GST基因家族的研究主要集中在苔藓植物(如小立碗藓)、裸子植物(如油松)和被子植物(如杨树),缺乏对蕨类植物的研究。本研究以江南卷柏为对象,利用序列搜索、系统发生分析、分子克隆、蛋白表达纯化和酶活测定等方法,对江南卷柏GST基因家族进行了分子进化、基因表达、蛋白功能分析,获得如下结果：1.在江南卷柏基因组中一共鉴定得到了65个GST基因,分属于10个不同的亚家族：Tau、Phi、DHAR、Theta、Zeta、Lambda、EF1Bγ、Ure2p、TCHQD、Hemerythrin和Iota。通过保守结构域预测,这65个基因都具有典型的GST结构域。2.Tau类GST是江南卷柏中成员最多的亚家族,在所有陆地植物中,只有最低等的苔藓植物小立碗藓没有Tau类GST的存在,其他四种具有维管结构植物都存在拷贝数最多的Tau类GST,这表明Tau类GST可能起源于维管植物。通过染色体定位,我们发现Tau类GST是以串联重复的方式在江南卷柏基因组中快速扩张的。对于Phi类GST,在其他陆地植物中都有八个以上成员,而在江南卷柏中只有两个,此外,两个Phi类GSTs在不同pH和温度条件下进行活性分析发现,它们在pH 6.0-9.5,以及30-65℃范围内均具有较高的催化活性,表明这两个蛋白能在比较宽的环境变化条件下发挥功能,预示着这两Phi类GST基因可能对江南卷柏适应复杂的陆地环境具有重要作用。3.组织特异性表达模式分析发现,有41个基因在根、茎和叶三个组织中都有表达,有20个基因在三个组织中部分表达,有四个基因(SmGSTU14、SmGSTU22、 SmGSTU47、SmGSTT1)在三个组织中都不表达,表明江南卷柏GST基因家族的表达模式发生了分化。4.对重组蛋白进行诱导表达并进行酶活测定发现,12个重组GST蛋白对CDNB都有催化活性,而对DHA没有检测到催化活性,并且不同的蛋白有不同的底物谱,同一亚家族内部,不同亚家族之间对底物的催化活性相差很大,说明江南卷柏GST基因家族成员之间存在着明显的功能分化。综合基因序列、基因结构、系统发育、组织特异性表达模式、蛋白质生化功能的分析,本文发现江南卷柏GST基因家族在基因序列、基因结构、组织特异性表达模式、蛋白质生化功能等不同层次上存在着功能分化。通过系统分析和染色体定位,本文揭示了GST基因家族在陆地植物中的复杂进化模式。
【关键词】：谷胱甘肽转移酶 江南卷柏 基因克隆 基因表达模式 蛋白功能分化
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1 引言9-22
• 1.1 基因家族9-13
• 1.1.1 基因家族的形成及其扩张方式9-10
• 1.1.2 基因重复后的进化命运10-13
• 1.2 谷胱甘肽转移酶(GST)概述13-20
• 1.2.1 GST基因家族的分类和命名13-14
• 1.2.2 GST的基因结构14
• 1.2.3 GST的蛋白结构14-15
• 1.2.4 GST的主要催化机制15-16
• 1.2.5 GST的功能16-20
• 1.2.5.1 Tau和phi类GST16-18
• 1.2.5.2 Zeta和theta类GSTs18
• 1.2.5.3 DHAR和lambda类GSTs18-19
• 1.2.5.4 TCHQD类和Ure2p类GSTs19
• 1.2.5.5 Hemerythrin类和iota类GSTs19-20
• 1.2.5.6 微粒体类GSTs20
• 1.3 江南卷柏基因组简介20
• 1.4 本论文的目的和意义20-22
• 2 江南卷柏GST基因的鉴定和表达模式研究22-33
• 2.1 材料和方法22-24
• 2.1.1 实验材料22
• 2.1.2 基因的搜索和鉴定22
• 2.1.3 引物设计22
• 2.1.4 总RNA的提取22-23
• 2.1.5 RNA反转录成cDNA23
• 2.1.6 系统发生关系分析23-24
• 2.1.7 序列相似性分析和基因结构分析24
• 2.1.8 江南卷柏GST基因家族的表达模式分析24
• 2.2 结果与分析24-32
• 2.2.1 序列搜索与鉴定24-25
• 2.2.2 系统发生分析25-26
• 2.2.3 基因结构分析26-27
• 2.2.4 Tau类GST扩张机制27-28
• 2.2.5 GST在陆地植物中的进化28-29
• 2.2.6 江南卷柏GST基因家族表达模式分析29-32
• 2.2.6.1 江南卷柏总RNA的提取29-30
• 2.2.6.2 江南卷柏GST基因家族表达模式分析30-32
• 2.3 讨论32-33
• 3 江南卷柏GSTs蛋白质的功能分化研究33-44
• 3.1 实验方法33-38
• 3.1.1 表达引物设计33
• 3.1.2 PCR扩增33
• 3.1.3 DNA回收33-34
• 3.1.4 大肠杆菌BL21感受态的制备34-35
• 3.1.5 重组表达载体的构建35-36
• 3.1.5.1 质粒的提取35
• 3.1.5.2 载体双酶切35-36
• 3.1.5.3 连接36
• 3.1.5.4 转化36
• 3.1.6 阳性重组子的鉴定36-37
• 3.1.7 重组蛋白的原核表达37
• 3.1.8 重组蛋白的纯化37-38
• 3.1.9 重组蛋白的酶学活性检测38
• 3.2 结果和分析38-43
• 3.2.1 江南卷柏GST基因表达载体的构建38-39
• 3.2.2 重组蛋白的诱导和纯化39-40
• 3.2.3 重组蛋白的酶学活性分析40-43
• 3.2.3.1 底物活性的分析40-41
• 3.2.3.2 重组蛋白的动力学分析41
• 3.2.3.3 重组蛋白的pH依赖性和温度依赖性分析41-43
• 3.3 讨论43-44
• 4 结论44-45
• 参考文献45-51
• 附录51-59
• 个人简介59-60
• 导师简介60-62
• 致谢62

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本文编号：265392