miR-193b靶向RAB22A基因调节外泌体介导的乳腺癌细胞增殖和转移的作用机制研究

发布时间：2020-04-22 15:24

【摘要】：目的与背景:乳腺癌是影响全世界女性健康的恶性肿瘤类型之一。其患者多因肿瘤生长与转移而引起的并发症而死亡,这需要更好地理解导致疾病进展的生物学基础,从而发现减缓其生长与转移的新方法。最近的研究表明,mi R-193b在多种肿瘤细胞的生长过程中发挥着重要的抑制作用,并且与患者的临床病理特征和预后联系紧密。RAB22A是原癌基因RAS家族的成员,在外泌体的形成,运输和代谢中起重要作用,并且与多种人类癌症的发生和发展有关,但其在乳腺癌中具体的作用机制仍不清楚。外泌体是由细胞产生并分泌至细胞外的微囊泡,依靠其内含有的特殊递质成分在细胞之间传递特殊的生物信号,从而影响到肿瘤细胞的生长能力。在本文中我们将通过检测细胞与组织中RAB22A基因与mi R-193b的表达水平,明确在不同样本中二者表达水平间的相互关系;探讨调控RAB22A表达对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用及与mi R-193b的关系;研究RAB22A基因所介导的外泌体产生与发挥功能在乳腺癌细胞生长中所起到的作用。这些研究可能对乳腺癌的靶向治疗方式的选择具有一定意义。方法:检测RAB22A与mi R-193b的表达:收集242例浸润性乳腺癌患者的组织,以及乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-468、ZR-75、T47D和乳腺上皮细胞MCF-10A,通过RT-q PCR及免疫蛋白印迹实验,检测RAB22A与mi R-193b的表达水平及相对关系。此外,用免疫组织化学技术分析这部分患者癌组织内RAB22A的表达水平,探讨其与患者年龄、临床分期、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移情况等乳腺癌预后影响因素间的关系。利用Kaplan-Meier生存曲线评价高表达RAB22A基因对患者预后的影响能力。建立低表达RAB22A基因的细胞模型:分别建立mi R-193b过表达的MCF-7和SK-BR-3细胞模型,利用RT-q PCR检测实验组与对照组细胞中mi R-193b的表达,证实转染效果;同时观察过表达mi R-193b后对于RAB22A的影响。在过表达mi R-193b的细胞中转染去除了mi R-193b结合位点的pc DNA3.1-RAB22A或pc DNA3.1,观察转染细胞的生长情况,证实RAB22A与mi R-193b的调节关系;使用克隆有HBLV-RAB22A sh RNA-Puro(sh RAB22A)的慢病毒感染MCF-7和SK-BR-3细胞,HBLV-Scramble-Puro control(SC)用于阴性对照,利用RT-q PCR及免疫蛋白印迹实验证实RAB22A基因的敲减效果。外泌体的提取与酶处理:分别收集处于对数生长期的细胞培养上清液,在4℃进行2次110,000g,各70分钟的超高速离心,PBS溶液重悬沉淀,提取外泌体进行分析。从SK-BR-3细胞所提取的外泌体使用蛋白酶及RNA酶对其内所含的蛋白及RNA进行灭活用于去除外泌体。外泌体摄取实验:被Di O探针标记的外泌体与SK-BR-3细胞共培养24小时,PBS冲洗后,用4%多聚甲醛固定15分钟,并在室温下用DAPI染色细胞核5分钟。放置于荧光共聚焦显微镜下观察并拍照。外泌体与细胞的共育实验:MCF-7、SK-BR-3细胞中加入待实验的外泌体至其终浓度达到20μg/ml,放置于37℃,5%CO2恒温恒湿培养2天后,收集细胞用于后续实验研究。细胞增殖实验:观察低表达RAB22A基因或与外泌体共育后对MCF-7或SK-BR-3细胞生长速率的影响。克隆形成实验用于评价敲减RAB22A基因对MCF-7或SK-BR-3细胞增殖能力的作用。使用Transwell细胞迁移与浸润实验来评价敲减RAB22A基因或去除外泌体后,对SK-BR-3细胞迁移与侵袭能力的影响。结果:1.人类乳腺癌细胞与组织中RAB22A基因与mi R-193b的表达:本研究证明了高表达RAB22A基因与乳腺癌进展和肿瘤的淋巴结转移有关,并提示临床预后不良。通过检测RAB22A基因和mi R-193b的表达水平,发现在乳腺癌细胞与组织中RAB22A基因水平与蛋白含量均升高,尤其在腋下淋巴结转移组织中,其增高程度最为明显,且RAB22A基因和mi R-193b的表达水平在癌细胞或癌组织内与乳腺上皮细胞或正常乳腺组织的相反。2.过表达mi R-193b与RAB22A基因的关系:转染mi R-193b后,在MCF-7和SK-BR-3细胞内,相较对照组,实验组mi R-193b的表达水平升高至~8倍和~10倍,而RAB22A基因表达降低~60%和~80%,同时RAB22A蛋白的含量降低至~40%和~30%。3.RAB22A基因与乳腺癌细胞增殖的关系:在转染了去除mi R-193b结合位点的RAB22A基因的过表达mi R-193b的细胞中,过表达mi R-193b与RAB22A的SK-BR-3细胞的增殖情况恢复到与阴性对照组细胞持平,显著强于单独转染mi R-193b的实验组;而单独过表达RAB22A,对SK-BR-3细胞的增殖能力的促进作用则明显高于阴性对照组。4.敲减RAB22A基因与乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的关系:在MCF-7和SK-BR-3细胞中敲减RAB22A后,RAB22A表达水平降低至对照细胞的~30%和~35%,RAB22A蛋白含量降低至~50%和~20%。将过表达mi R-193b或敲减RAB22A的SK-BR-3细胞培养至第三天,发现低表达RAB22A基因即失去了对细胞增殖的促进作用,该现象随天数的增加而愈加显著;而在MCF-7细胞中,低表达RAB22A基因失去对细胞增殖的促进作用在第四天以后即有明显的表现。此外,MCF-7和SK-BR-3细胞在敲减RAB22A基因后克隆形成数量为阴性对照组克隆形成数量的~20%和~30%。并且,低表达RAB22A基因能够使SK-BR-3细胞迁移的能力降低~55%,侵袭的能力降低~40%。5.RAB22A基因与外泌体的关系:对比于阴性对照细胞,低表达RAB22A基因使贴合在SK-BR-3细胞的外泌体信号减少,此外可以发现实验组外泌体内的标记蛋白TSG101及载质蛋白HSP70的含量均出现降低,而在细胞的总蛋白提取物中,这一现象并未被观测到。6.受RAB22A基因调节的外泌体对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响:将外泌体与细胞共培养至第三天后,可以发现额外添加阴性对照组细胞所分泌的外泌体能够恢复低表达RAB22A基因对SK-BR-3细胞增殖能力的影响,而在对这部分外泌体进行酶处理后,恢复细胞增殖能力的作用消失。同样,由低表达RAB22A基因的细胞所分泌的外泌体也失去恢复细胞增殖能力的作用。相似的实验结果可以在MCF-7细胞中得到重复。敲减RAB22A基因的SK-BR-3乳腺癌细胞,与添加未被酶处理外泌体共培养的细胞相比照,去除外泌体内的蛋白与RNA成分后,促进细胞迁移的能力失去了~40%,促进侵袭的能力失去了~30%。结论:1.RAB22A基因的表达上调与乳腺肿瘤形成及淋巴结转移呈正相关,可作为提示乳腺癌临床预后水平的标志物之一。2.mi R-193b通过靶向调控RAB22A基因的表达抑制乳腺癌细胞的增殖。3.RAB22A基因具有促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的能力,而此能力可能与其调节外泌体的合成与分泌有关。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

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