赤眼鳟Mx1基因cDNA克隆表达及转ScMx基因草鱼初探

发布时间：2020-04-24 10:43

【摘要】：抗黏液病毒(Myxovirus resistance,Mx)基因是在干扰素(Interferon,IFN)诱导下产生的具有抗病毒活性的因子,在生物界广泛存在。Mx基因编码的蛋白,其抗病毒作用的发挥与其典型的结构密切相关。在鱼类中,也存在多种Mx基因,并在鱼类天然免疫应答中发挥着不同程度的抗病毒作用。因此,本研究利用RACE技术克隆了赤眼鳟Mx基因亚型(ScMx1),并利用荧光定量PCR技术,对ScMx1和ScIFN-I在GCRV感染条件下的表达特征进行了探究。此外,使用本团队刘敏构建的含赤眼鳟Mx基因(ScMx)的重组质粒ScMxORF-pTgf2-L-R,结合Tgf2高效转座系统,在草鱼中初步开展了转基因研究。本研究获得的主要结果如下:(1)ScMx1基因的cDNA克隆及序列分析结果ScMx1的cDNA全长为3 000bp,包括5′非编码区124 bp,3′非编码区983 bp,开放阅读框为1 893 bp,编码630个氨基酸。ScMx1基因编码的蛋白结构具有脊椎动物Mx蛋白的共同特征,在N端的GTP酶结构域(含一个三联体GTP结合区域和一个动力蛋白信号),中间结构域和C端的GTP酶效应结构域(含亮氨酸拉链区域)。ScMx1与其他物种的相似性比较发现,ScMx1与青鱼bcMx1、草鱼CiMx1和CiMx3的相似性较高,分别为97%、95%和97%;而ScMx1与ScMx、CiMx2、鲫鱼Mx2等鱼类的相似性较低,只有49%~50%。通过构建系统进化树表明,ScMx1与bcMx、CiMx3、CiMx1等鲤科鱼类进化关系较近,与ScMx、CiMx2等鲤科鱼类进化关系较远。为进一步研究ScMx1以及ScMx的抗病毒功能奠定了理论基础。(2)ScMx1基因的表达分析结果ScMx1在赤眼鳟鳃、肝脏、脾脏、体肾、头肾、脑、皮肤、肌肉、肠和心脏共10个组织中均能够检测到,其中,ScMx1在脾脏中的表达量最高,其次是心脏,在肠和肝脏中的表达量相对较低。人工感染GCRV后(6 h,12 h,24 h,72 h,168 h),ScMx1与ScIFN-I在所检测的肝脏、脾脏、体肾和头肾4个组织中的表达量与对照组相比,均显著上调;但不同的组织,ScMx基因和ScIFN-I基因具有不同的表达特征。在肝脏和体肾中,ScMx1持续上调至168 h,而ScIFN-I在72h时达到峰值。在脾脏和头肾中,ScMx1和ScIFN-I均在72 h时出现峰值。总之,ScMx1基因参与了赤眼鳟抵抗GCRV的免疫应答反应。(3)转ScMx基因在草鱼中的初步研究结果采用显微注射法将重组质粒ScMxORF-pTgf2-L-R和辅助质粒pCS2-CMV-gfTP导入草鱼受精卵中,共注射约6 000粒卵;经过胚胎培养6个月,统计得到6月龄的转基因草鱼共206尾,计算存活率为3.4%。进一步对存活的全样本进行PCR检测,得到阳性整合率为37.9%,最终筛选出一批转ScMx基因草鱼阳性群体。为转基因草鱼的抗病育种工作奠定了基础。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】