下调Fsp27基因联合杨梅素干预对3T3-L1细胞脂解的影响及机制探究

发布时间：2020-05-01 10:04

【摘要】：目的:采用RNAi干扰技术联合杨梅素(Myricetin,Myric)下调脂肪特异性蛋白(fatspecific protein of 27 kD,Fsp27)的表达,观察对3T3-L1细胞中脂代谢的影响,并对脂滴发生、发展变化的调控机制进行探究,为肥胖症的防治提供新的理论基础和药物筛选靶点。方法:1.采用基因编辑技术克隆构建针对Fsp27的3个sh-RNA阳性干扰载体和1个阴性对照载体,并通过DNA测序法对其进行鉴定。2.常规培养3T3-L1前脂肪细胞,采用“鸡尾酒法”,使其诱导分化为成熟脂肪细胞。脂质体法转染细胞。实验分为四组:对照组(control group)、转染组(sh-RNA group)、杨梅素组(Myric group)和联合干预组(Myric+sh-RNA group)。脂肪细胞转染5 h后,杨梅素组和联合干预组以浓度为100μmol/L的Myric干预72 h。3.转染成功后,用油红O对脂滴进行染色,观察脂滴形态及大小的变化;用酶法测定细胞中甘油及甘油三酯(TG)的含量,观察细胞脂代谢的变化。4.Western blot检测Fsp27、HSL、ATGL、p38MAPK、p-p38MAPK和PPARγ的表达量。结果:1.诱导分化结束后,3T3-L1细胞形态由纤维样变成圆形,并伴随有细胞体积的增大。油红O染色后,脂滴呈“戒环样”分布于细胞核周围。2.脂质体转染后,3个sh-RNA阳性干扰载体与阴性对照组相比,均能有效下调Fsp27的表达量,差异有统计学意义(P0.05)。3.干预后,与对照组相比,杨梅素(Myric)组的细胞中甘油三酯(TG)含量下降,甘油含量升高,差异有统计学意义(P0.05),但sh-RNA转染组和杨梅素(Myric)组二者之间没有差异(P0.05)。与其他三组相比,Myric+sh-RNA组细胞中TG含量明显减少,甘油含量显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。4.干预后,与对照组相比,其余三组细胞内Fsp27的表达量均显著降低;ATGL和PPARγ的表达量升高(P0.05)。另外,Myric+sh-RNA组和Myric组细胞内HSL的表达量和p-p38MAPK/p38MAPK的比值均大于sh-RNA组和对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.3个sh-RNA阳性干扰载体构建成功,并且可有效下调Fsp27蛋白的表达。2.Fsp27基因沉默与杨梅素联合干预可以更大程度地促进脂肪分解代谢。3.杨梅素可通过激活MAPK信号通路,上调HSL和ATGL的蛋白表达来发挥其促脂解的作用;sh-Fsp27高效干扰载体只是通过调节PPARγ和Fsp27蛋白的表达,增加ATGL含量来加速脂肪分解,可能对MAPK信号通路并不产生作用。
【图文】：

图 1-1 GV104 真核表达载体表 1-1 小鼠 sh-Fsp27 重组载体靶点 干扰靶点序列 起始位置 GC 含量1 ACCCTCTATGACACATACT 549 422 GGACATCTTGAAACTTAAA 269 313 CTCCTGTAAGTAACCTAAA 1507 360 TTCTCCGAACGTGTCACGT 222 52的转化μL 质粒加入 100μLDH5α 大肠杆菌感受态细胞中，，轻弹管壁数下混30 min。42 ℃热激 90 s，冰水浴孵育 2 min。加入 500 μL LB 液体培摇床摇菌 1 h。

图 1-2 sh-Fsp27 质粒电泳鉴定注 1：sh-Fsp27-0；2：sh-Fsp27-1；3：sh-Fsp27-2；4：sh-Fsp27-3Fsp27 重组干扰载体的测序鉴定 DNA 测序结果证实，3 个 sh-Fsp27 阳性干扰载体中的插入的 sh，与预期设计合成的序列相符合。见图 1-3。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R589.2

【参考文献】

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本文编号：2646533